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生物反應(yīng)器
生物功能模擬機
生物反應(yīng)器，是指利用自然存在的微生物或具有特殊降解能力的微生物接種至液相或固相的反應(yīng)系統(tǒng)。目前研究得最多的兩種反應(yīng)器是“升降機型反應(yīng)器”和“土壤泥漿反應(yīng)器”。升降機型反應(yīng)器是通過水相的流動來提供適當?shù)臓I養(yǎng)、碳源和氧氣，從而達到降解土壤中污染物質(zhì)的目的。與固相系統(tǒng)相比，生物反應(yīng)器能夠在更短的時間內(nèi)將污染物進行有效降解。該生物反應(yīng)器技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于有機污染土壤的生物修復(fù)中。
基本信息
| 中文名 | 生物反應(yīng)器 |
| 外文名 | Bioreactor |
| 利用 | 酶或生物體 |
| 性質(zhì) | 醫(yī)學(xué)器械 |
簡介
概述
名稱：生物反應(yīng)器
主題詞或關(guān)鍵詞：DNA生命科學(xué)細菌胰島素
生物反應(yīng)器：生物反應(yīng)器是利用生物體所具有的生物功能，在體外或體內(nèi)通過生化反應(yīng)或生物自身的代謝獲得目標產(chǎn)物的裝置系統(tǒng)、細胞、組織器官等等。
內(nèi)容
生物反應(yīng)器聽起來有些陌生，基本原理卻相當簡單。胃就是人體內(nèi)部加工食物的一個復(fù)雜生物反應(yīng)器。食物在胃里經(jīng)過各種酶的消化，變成我們能吸收的營養(yǎng)成分。生物工程上的生物反應(yīng)器是在體外模擬生物體的功能，設(shè)計出來用于生產(chǎn)或檢測各種化學(xué)品的反應(yīng)裝置?；蛘哒f，生物反應(yīng)器是利用酶或生物體（如微生物）所具有的生物功能，在體外進行生化反應(yīng)的裝置系統(tǒng)，是一種生物功能模擬機，如發(fā)酵罐、固定化酶或固定化細胞反應(yīng)器等。
在固定化酶廣泛應(yīng)用的基礎(chǔ)上，人們發(fā)現(xiàn)天然細胞本身就具有多功能的系列化反應(yīng)系統(tǒng)采用物理或化學(xué)方法將細胞固定化，是利用酶或酶系的一條捷徑。一個固定化細胞反應(yīng)器猶如一臺“生命活動功能推動機”。固定化細胞技術(shù)開始于70年代，其實際應(yīng)用程度已超過固定化酶。如美國、歐洲、日本均采用固定化菌體柱床工藝大規(guī)模生產(chǎn)高果糖漿。
輸卵管
膜生物反應(yīng)器
1994年11月（Glodegg Plan）和1995年3月及1996年轉(zhuǎn)基因動物通訊、1995年7月上海首屆國際生物技術(shù)與藥物學(xué)術(shù)研討暨展覽會、1996年11月北京第1屆國際暨第3屆全國轉(zhuǎn)基因動物學(xué)術(shù)研討會（秘書長曾邦哲）、1997年生物技術(shù)通報發(fā)表，并創(chuàng)造了“輸卵管生物反應(yīng)器（oviduct bioreactor）”一術(shù)語與詞匯，以及1999年在德國創(chuàng)建的系統(tǒng)生物科學(xué)與工程網(wǎng)站闡述了輸卵管生物反應(yīng)器（oviduct bioreactor）概念、方法與技術(shù)研究。
1996年創(chuàng)辦第1屆國際轉(zhuǎn)基因?qū)W術(shù)研討會期間，曾邦哲與加拿大、美國、英國、日本有關(guān)轉(zhuǎn)基因禽類實驗室聯(lián)系，但國際上當時沒有人開展這項課題，隨后與美國Avigenics公司和Georgia大學(xué)R.Ivarie教授探討了輸卵管生物反應(yīng)器的合作研究。
1998年，美國Avigenics公司獨立開展了規(guī)?；顿Y與研究開發(fā)輸卵管生物反應(yīng)器，因中國科學(xué)家曾邦哲已經(jīng)去了以色列。2002年后，國際國內(nèi)掀起了輸卵管生物反應(yīng)器的研究開發(fā)熱潮，2003年Science發(fā)表了Gloden Egg的評述文章。
目前，國際上已有十多家前景看好的公司以輸卵管生物反應(yīng)器作為拳頭開發(fā)產(chǎn)品，約2003年英國羅斯林研究所也創(chuàng)建了公司，并由Sang博士主持研究課題，從禽類蛋黃表達系統(tǒng)轉(zhuǎn)向了輸卵管生物反應(yīng)器。輸卵管生物反應(yīng)器將稱為繼哺乳動物乳腺生物反應(yīng)器后最具發(fā)展前景的動物生物反應(yīng)器。
基因構(gòu)建
《國外醫(yī)學(xué)》預(yù)防、診斷、治療用生物制品分冊1999年第22卷第5期
關(guān)鍵詞：轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器 藥物 基因構(gòu)建 表達
摘要 近年來，生物學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的成就促進了轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的蓬勃發(fā)展。用轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)藥用蛋白是生物技術(shù)領(lǐng)域里的又一次革命，它以一個全新生產(chǎn)珍貴藥用蛋白的模式區(qū)別于傳統(tǒng)藥物的生產(chǎn)。本文著重介紹轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的基因構(gòu)建以及轉(zhuǎn)基因動物組織特異性表達的最新進展。
生物反應(yīng)器
同源組織
目前，在同源組織中表達蛋白質(zhì)最典型的例子是在動物的紅細胞中表達人的血紅蛋白。在人的血紅蛋白基因編碼序列里啟動子有2個CACCC盒，而對應(yīng)的豬的啟動子里只有一個，另一個靠近它的是CGCCC盒。Sharma等[1]將豬的β-啟動子與人的β編碼基因融合，并將人的β-基因座調(diào)控區(qū)（β-LCR）和α、ε基因與融合基因的β基因連接在一起構(gòu)成載體，轉(zhuǎn)入豬胚胎細胞，從轉(zhuǎn)基因豬分泌乳汁中得到的重組人血紅蛋白含量高達32g/L。
生產(chǎn)蛋白
轉(zhuǎn)基因動物表達重組蛋白多以乳腺、唾液腺和膀胱為靶位。在這些表達器官中，通過構(gòu)建合適的載體，選擇適當?shù)膯幼雍?/span>調(diào)控序列可產(chǎn)生比正常水平高得多的重組蛋白。不過，生產(chǎn)系統(tǒng)應(yīng)盡可能與循環(huán)系統(tǒng)隔離，以減少表達產(chǎn)物對宿主動物的影響。
乳腺生物
將所需目的基因構(gòu)建入載體，加上適當?shù)恼{(diào)控序列，轉(zhuǎn)入動物胚胎細胞，使轉(zhuǎn)基因動物分泌的乳汁中含有所需要藥用蛋白。從融合基因轉(zhuǎn)入胚胎細胞到收集蛋白質(zhì)有一個過程，包括胚胎植入、分娩和轉(zhuǎn)基因動物的生長。轉(zhuǎn)基因動物從出生到第一次泌乳，豬、羊、牛各需12、14、16個月；并且只有雌性動物泌乳且不連續(xù)，一般可持續(xù)2、6、10個月。牛、羊等大型家畜能對藥用蛋白進行正確的后加工，使之具有較高的生物活性，同時產(chǎn)奶量大，易于大規(guī)模生產(chǎn)，因而成為乳腺生物反應(yīng)器理想的動物類型。
抗凝血酶Ⅲ
第一個進入臨床試驗的轉(zhuǎn)基因蛋白產(chǎn)物是抗凝血酶Ⅲ，將半乳糖β-酪蛋白的啟動子和含抗凝血酶Ⅲ基因序列相連，轉(zhuǎn)入綿羊胚胎細胞，在轉(zhuǎn)基因綿羊的乳液中得到有生物活性的蛋白產(chǎn)量可達7g/L[2]。目前該蛋白正用于冠狀動脈旁路手術(shù)患者的二期臨床驗證。
在實驗過程中人們發(fā)現(xiàn)牛的β-乳球蛋白（BLG）基因非常穩(wěn)定，并能在乳腺中特異性表達。Hyttinen等[3]將含有5'端2.8kb和3'端1.9kb的牛BLG基因片段構(gòu)建成載體，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，可在轉(zhuǎn)基因小鼠的乳腺中特異表達高水平的BLG，此外，還發(fā)現(xiàn)CpG位點的甲基化程度與BLG的表達量有關(guān)，甲基化少的轉(zhuǎn)基因小鼠乳液中BLG分泌量較大，可達1～2mg/ml，而其他轉(zhuǎn)基因小鼠分泌量小于0.1mg/ml。
紅細胞生成素
生物反應(yīng)器
因子Ⅸ
Schnieke等[6]將羊的BLG基因5'末端和人的因子Ⅸ cDNA 與含有BLG復(fù)制單元和3'末端的片段融合，將構(gòu)建的雜合基因轉(zhuǎn)入羊的胚胎細胞，從分泌的乳汁中得到125μg/ml的重組蛋白。黃淑幀教授等[7]構(gòu)建了一個含有小鼠MAR元件、牛β-酪蛋白基因調(diào)控序列和hFⅨ微基因的hFⅨ乳腺組織特異性表達載體pMCⅨm，其中hF Ⅸ微基因包括全長hF Ⅸ cDNA ，800bp經(jīng)過改造的內(nèi)含子1序列和hFⅨ蛋白的信號肽序列。將線形化的表達載體pMC Ⅸm導(dǎo)入羊的受精卵。轉(zhuǎn)基因羊分泌的乳汁中hFⅨ蛋白的含量約為95ng/ml。在另一實驗中，Yull等[8]將BLG5'末端序列，fⅨ編碼序列和缺失隱性3'端連接點的f Ⅸ3'末端不翻譯區(qū)域的一個小片段融合，構(gòu)成雜合基因，去掉SphI和SmaI位點，克隆入移去了pBJ41的SphI/EcoRV。轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，得到的重組蛋白產(chǎn)量達0.06mg/ml。經(jīng)過進一步研究，發(fā)現(xiàn)是轉(zhuǎn)基因動物乳腺中對DNA的錯誤剪切使分泌量降低，從而增高重組蛋白產(chǎn)率。在乳腺組織中表達有完全活性的因子Ⅸ是比較成功的，尤其是乳腺組織對因子Ⅸ N端附近的一段含12個葡萄糖殘基的序列進行γ-羧化以保持其活性，而在以前的天然蛋白中沒有發(fā)現(xiàn)γ-羧化作用。
因子Ⅷ
人FⅧcDNA長約7.2kb，是目前為止表達的最長cDNA。將它插入小鼠的乳清酸性蛋白（WAP）基因中啟動子（2.5kb）的下游，使之在乳腺中靶向分泌FⅧ重組蛋白。在WAP/FⅧcDNA構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因小鼠中rFⅧ表達最低，而在轉(zhuǎn)基因豬中可達1.0～2.7μg/ml[9]。
單克降抗體
Castilla等[10]將編碼了重組單克降抗體（rMab）6A.C3的免疫球蛋白基因cDNA插入小鼠WAP dNA基因組的第一個外顯子，使rMab 6A.C3的表達可以由WAP基因調(diào)控序列來控制，將構(gòu)建的雜合基因注入小鼠胚胎細胞原核，使小鼠乳腺分泌有活性的單克降抗體，這種轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物將廣泛應(yīng)用于預(yù)防新生兒腸道感染。
C蛋白
同樣在WAP基因的第一個外顯子位點，Drews等[11]將人C蛋白cDNA插入，轉(zhuǎn)入小鼠胚胎細胞，可得到產(chǎn)量達1.6mg/ml的重組蛋白。而將上述雜合基因轉(zhuǎn)入豬的胚胎細胞，可使豬分泌出380μg/mlμg/ml·hr的外源蛋白，活性與人血漿中C蛋白的活性相同。由于C蛋白的抗凝活性依賴于輕鏈膜結(jié)合區(qū)域正確的γ-羧化，因此，轉(zhuǎn)基因豬能分泌有活性的C蛋白表明豬的乳腺細胞可對C蛋白前體高速率地進行γ-羧化，以使成熟C蛋白有完整的活性。
優(yōu)點
1.成本低
2.設(shè)備簡單
3.效率高
4.產(chǎn)品作用效果顯著
5.減少工業(yè)污染
應(yīng)用
1.改良乳汁品質(zhì)；
2.生產(chǎn)藥用蛋白。
3.外源基因在動物體內(nèi)的位點整合問題；
4.乳蛋白基因表達組織特異性問題；
5.目的蛋白的翻譯后修飾問題；
6.轉(zhuǎn)基因表達產(chǎn)物的分離和純化問題；
7.轉(zhuǎn)基因的技術(shù)與方法問題；
膀胱生物反應(yīng)器
膀胱反應(yīng)器有著和乳腺反應(yīng)器一樣的優(yōu)點：收集產(chǎn)物蛋白比較容易，不必對動物造成傷害。此外，該系統(tǒng)可從動物一出生就收集產(chǎn)物，不論動物的性別和是否正處于生殖期。膀胱生物反應(yīng)器最顯著的優(yōu)勢在于從尿中提取蛋白質(zhì)比在乳汁中提取簡便、高效。
膀胱生物反應(yīng)器多用Uroplakin啟動子啟動人生長激素（hGH）的表達，產(chǎn)生 hGH特異性的高豐度RNA，這些RNA與蛋白分泌量高度相關(guān)。Uroplakin基因在多種哺乳動物體內(nèi)有很高的保守性，如鼠、兔、牛、羊和人等。
生長激素 Kerr等[12]將pUPII-LacI用質(zhì)粒的Kpn i進行消化，用T4DNA多聚酶切去3'端，然后用BamHI消化，分離出3.6kb的5'端小鼠UPII基因片段，此片段含有膀胱反應(yīng)器特異性表達所需的大部分序列。將此片段與位于無啟動子的pOGH質(zhì)粒純化SaI和BamHI位點間的hGH結(jié)構(gòu)基因的5'端連接，得到pUPII-hGH質(zhì)粒，能表達該質(zhì)粒的組織分布有限。將得到的pUPII- hGH質(zhì)粒用HindIII和EcoRI消化，得出一段5.7kb的UPII-hGH融合基因可用于顯微注射，在膀胱上皮細胞中合成hGH，收集轉(zhuǎn)基因動物尿液，從中提取重組蛋白。但在這一途徑中轉(zhuǎn)基因動物會因hGH的作用逐漸肥胖，并導(dǎo)致雌性動物不育癥。乳腺生物反應(yīng)器也能表達hGH。用同源重組方法將hGH基因?qū)?10kb的人α-乳球蛋白位置依賴性YAC載體，將重組的YAC dNA顯微注入大鼠胚胎，轉(zhuǎn)基因大鼠的乳汁中含有高水平的hGH，含量可達0.25～8.9mg/ml[13]。
翻譯與修飾
轉(zhuǎn)基因動物分泌的蛋白，特別是糖鏈成分的結(jié)構(gòu)與人體蛋白有差異。因此研究分泌蛋白的修飾就顯得很重要。在乳腺生物反應(yīng)器中，蛋白質(zhì)翻譯前修飾的主要方式是在多個位點對乳腺中的蛋白前體進行信號肽剪切和對糖鏈進行修飾。例如，從山羊乳液中得到的長效組織型纖溶酶原激活劑與人體內(nèi)和相比較，含有少量的異種（外源）低聚糖，同時，唾液酸、N-乙酰葡萄糖胺和半乳糖含量明顯減少，關(guān)且出現(xiàn)缺少蛋白質(zhì)C127的N-乙酰半乳糖胺。此外，從豬乳液中得到的C蛋白中是沒有的；從羊乳液中得到的重組α1-抗胰蛋白酶多聚肽也反映了唾液酸酸化程度的差異；在山羊乳腺中觀察到了重組抗凝血酶Ⅲ上低聚甘露糖與特異天冬酰胺的位點特異性聚合等等。研究小鼠乳液中的重組γ-干擾素可對翻譯前修飾有更好的理解，γ-干擾素有大量的位點特異性變化，在N端連接位點進行復(fù)雜的唾液酸酸化和連接核心巖藻多聚糖，其次是低聚甘露糖。與從小鼠細胞中取得的蛋白質(zhì)相比，分泌的重組蛋白沒有GalNAc、NeuGC和Gal∞l 、3Gal-βl、 4GlcNAc殘基。這些蛋白特異性的糖基化類型可與細胞上的受體結(jié)合并清除病人體內(nèi)的重組蛋白，因此可能會影響療效，最終的結(jié)果尚有待驗證。
同源組織表達蛋白質(zhì)的優(yōu)點是可對表達產(chǎn)物進行調(diào)控并校正珠蛋白鏈的翻譯過程，避免無效的翻譯前修飾，使產(chǎn)物蛋白盡可能與人體天然蛋白相似，降低人體內(nèi)的排斥反應(yīng)，提高藥物蛋白療效。目前，蛋白分離技術(shù)飛速發(fā)展，大大提高了蛋白質(zhì)分離的可行性和分離效率。第二種技術(shù)路線中目前以乳腺生物反應(yīng)器較為多見，因為乳汁易得到，且乳汁中的特異蛋白含量較大，對蛋白水解酶的降解作用也比較穩(wěn)定。乳汁是一種混合物，含3%～6%的總蛋白，3%～5%的脂類，對蛋白提純技術(shù)要求比較高。另一方面，藥用蛋白是在動物乳腺中產(chǎn)生。因此只有含轉(zhuǎn)基因型人雌性動物在泌乳期才能生產(chǎn)藥用蛋白，可用的動物數(shù)目有限，且生產(chǎn)期較短。膀胱生物反應(yīng)器的優(yōu)點在于含有轉(zhuǎn)基因型的兩性動物都可用，產(chǎn)后收集時間長，提取產(chǎn)物蛋白濃度雙乳液中的含量低得多，盡管收集的尿液多且時間長，生產(chǎn)單位數(shù)量的藥用蛋白在乳腺和膀胱生物反應(yīng)器中的成本是差不多的
問題與展望
在轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的應(yīng)用中，有些問題尚待解決。比如，由于轉(zhuǎn)基因動物的基因是鑲嵌整合型的，因此它的下一代并不都轉(zhuǎn)基因型。但是在綿羊，豬和山羊中觀察到只要轉(zhuǎn)基因型從起始個體傳給了下一代，這種轉(zhuǎn)基因型就可以穩(wěn)定地遺傳好幾代。而其他一些因素，如外源基因的整合率低，胚胎移植的受孕率低等都使有效的轉(zhuǎn)基因動物大大減少。同時，由于對調(diào)控表達水平的程序，指導(dǎo)進行精確的組織特異性和發(fā)育調(diào)控表達的程序，以及調(diào)控和編碼內(nèi)含子序列間可能的相互作用的認識尚不充分[14]，容易引起異位點表達；由于現(xiàn)在的技術(shù)還不能控制整合的位點，因此存在對內(nèi)源基因進行插入誘變的可能性，轉(zhuǎn)基因型的表達會受整合的不同位點的影響。這些因素使得在家畜長成前，要用小鼠對新基因構(gòu)型進行常規(guī)試驗。
轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的藥用蛋白可用于預(yù)防和治療疾病，其轉(zhuǎn)運系統(tǒng)及口服用藥引起的耐受性等問題都在作進一步研究。以轉(zhuǎn)基因家畜生產(chǎn)珍貴的藥用蛋白具有重大的經(jīng)濟價值和社會效益，這項生物技術(shù)最終將會得到廣泛應(yīng)用。
發(fā)展階段
生物反應(yīng)器（bioreactor）經(jīng)歷了三個發(fā)展階段：細菌基因工程、細胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器。轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的出現(xiàn)之所以受到人們極大的關(guān)注，是因為它克服了前兩者的缺陷，即細菌基因工程產(chǎn)物往往不具備生物活性，必須經(jīng)過糖基化、羥基化等一系列修飾加工后才能成為有效的藥物，而細胞基因工程又因為哺乳動物細胞的培養(yǎng)條件要求相當苛刻、成本太高而限制了規(guī)模生產(chǎn)。另外，轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器還具有產(chǎn)品質(zhì)量高、容易提純的特點。一般把目的片段在器官或組織中表達的轉(zhuǎn)基因動物叫做動物生物反應(yīng)器。幾乎任何有生命的器官、組織或其中一部分都可以經(jīng)過人為馴化為生物反應(yīng)器。從生產(chǎn)的角度考慮，生物反應(yīng)器選擇的組織或器官要方便產(chǎn)物的獲得，例如乳腺、膀胱、血液等，由此發(fā)展了動物乳腺生物反應(yīng)器、動物血液生物反應(yīng)器和動物膀胱生物反應(yīng)器等。其中，轉(zhuǎn)基因動物乳腺生物反應(yīng)器的研究最為引人注目。
轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器
用微生物、植物、動物或人細胞，或者用專一性酶通過生物方法將原料轉(zhuǎn)化為特定產(chǎn)品的容器稱為生物反應(yīng)器。通常微生物和細胞又涉如何維持它們的環(huán)境以提供最佳的生長條件的問題。生物反應(yīng)器能通過提供合適的條件：例如最佳溫度、pH、有效的底物、營養(yǎng)鹽、維他命和氧（對好氧有機物）來支持這個自然過程，使細胞能進行生長和新陳代謝。生物反應(yīng)器（bioreactor) 經(jīng)歷了3 個發(fā)展階段細菌基因工程、細胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器。細胞基因工程產(chǎn)物往往不具備生物活性，必須經(jīng)過糖基化、羥基化等一系列修飾加工后，才能成為有效的藥物，而細胞基因工程又因為哺乳動物細胞的培養(yǎng)條件要求相當苛刻，成本太高，限制了規(guī)模生產(chǎn)。動物生物反應(yīng)器具有產(chǎn)品質(zhì)量高，容易提純的特點，彌補了其它各類基因表達系統(tǒng)的缺陷。
轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器
利用基因工程培育新型微生物
等。轉(zhuǎn)基因動物最為誘人的前景是利用它生產(chǎn)人類所需要的生物活性產(chǎn)品或藥物。目前世界上有很多公司正在致力于這方面的研究。而轉(zhuǎn)基因家畜研究最為活躍的領(lǐng)域就是利用它們生產(chǎn)新的動物產(chǎn)品。通常把目的基因在血液循環(huán)系統(tǒng)或乳腺中表達的轉(zhuǎn)基因動物稱為動物生物反應(yīng)器，把家畜作為一種生物反映器，生產(chǎn)人類所需的藥用蛋白，包括治療用藥物、激素和抗體等。
動物血液生物反應(yīng)器
近年來，動物血液生物反應(yīng)器取得了很大進展。血液生物反應(yīng)器比較適合生產(chǎn)人血紅蛋白、抗體和生產(chǎn)非生物學(xué)活性狀態(tài)的融合蛋白，而有活性的蛋白或多肽（如激素、細胞分裂素、組織血纖維溶酶因子等）由于進入了動物血液循環(huán)系統(tǒng)而影響動物的健康。到目前為止，已有多種通過轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的具有生物學(xué)功能的人血紅蛋白問世。
動物的乳腺生物反應(yīng)器
乳腺生物反應(yīng)器的原理是外源基因在乳腺特異性表達需要乳蛋白基因的一個啟動子和調(diào)控區(qū)，即引導(dǎo)泌乳蛋白基因表達的序列，將外源基因置于乳腺特異性調(diào)節(jié)序列之下，使之在乳腺中表達，通過回收乳汁獲得重要價值的生物活性蛋白。從目前的研究成果看，與傳統(tǒng)的原核系統(tǒng)及細胞發(fā)酵系統(tǒng)相比，動物乳腺生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品具有以下特點：生物活性高，無污染，純化簡單，產(chǎn)量高，成本低。目前，已克隆并用作構(gòu)建載體的乳蛋白基因主要有-乳球蛋白（BLG）基因、s1-酪蛋白基因、-酪蛋白基因、乳清酸蛋白（WAP）以及乳清蛋白基因[2]。大多數(shù)的乳蛋白基因的啟動子已用于外源基因在轉(zhuǎn)基因動物乳腺中的表達。s1-酪蛋白基因和-乳球蛋白的啟動子尚有未知因素的作用，它們在轉(zhuǎn)基因動物中表達水平低或表達不穩(wěn)定。-酪蛋白的啟動子在轉(zhuǎn)基因動物中表達水平也很低。綿羊-乳球蛋白、山羊酪蛋白和牛s1-酪蛋白啟動子在轉(zhuǎn)基因動物乳腺中維持異種蛋白的表達水平較高。如果得用目的基因的DNA序列而不是cDNA，表達效果可能會更好。不翻譯的外顯子和內(nèi)含子的摻入可能有利于
轉(zhuǎn)基因的表達。值得一提的是，利用乳腺生物反應(yīng)器生產(chǎn)的“新奇牛奶”已經(jīng)問世。2003 年，Brophy 等通過共轉(zhuǎn)染和嘌呤霉素篩選向牛胎兒成纖維細胞引入-s蛋白基因和-酪蛋白基因的多量拷貝，而后進行核移植生產(chǎn)出了8 頭轉(zhuǎn)基因奶牛，其產(chǎn)奶中酪蛋白總量較普通奶高30%。這種奶的蛋白和鈣含量提高，熱穩(wěn)定性增強而乳糜顆粒變小，其營養(yǎng)價值更高，也更適于奶酪生產(chǎn)[3]。
優(yōu)越性
轉(zhuǎn)基因動物的問世，為利用基因工程手段獲得低成本、高活性和高表達的產(chǎn)物開辟了一條重要途徑。作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動物，主要是利用其乳腺組織和血液組織進行定位表達，特別是用乳腺組織生產(chǎn)具有生物活性的多肽藥物和具有特殊營養(yǎng)意義的蛋白質(zhì)，已成為一個新興的轉(zhuǎn)基因制藥業(yè)，它的優(yōu)越性有如下幾點[4]。3.1 表達產(chǎn)物能充分修飾且具有穩(wěn)定的生物活性 利用DNA重組技術(shù)的微生物發(fā)酵工程來生產(chǎn)的藥用蛋白，由于細菌等微生物不能進行蛋白質(zhì)合成后的加工，因而生物活性低，并且具有免疫原性，而利用轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)藥用蛋白卻免除這些問題。
成本低可以大規(guī)模生產(chǎn)
作為生物反應(yīng)器的轉(zhuǎn)基因動物可無限擴繁，且飼養(yǎng)成本低，可進行大規(guī)模的藥物生產(chǎn)。而動物細胞生物反應(yīng)器，雖然能生產(chǎn)具有完全生物活性的產(chǎn)品，但以商業(yè)生產(chǎn)為目的的大規(guī)模的動物細胞培養(yǎng)，成本會極高且培養(yǎng)條件要求苛刻。
產(chǎn)品質(zhì)量高易提純
由動物生物反應(yīng)器生產(chǎn)的藥品為純的生物制品，避免了化學(xué)試劑及生物毒素的污染。目前，某些藥用蛋白生產(chǎn)已達每千克乳汁含幾十克，生物活性與天然蛋白幾乎完全一樣，極易提純?？傊?，動物生物反應(yīng)器彌補了其它各類基因表達系統(tǒng)的缺陷。
應(yīng)用
以動物的乳腺或其它組織作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)貴重的醫(yī)用蛋白，是動物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的另一特殊形式。由于轉(zhuǎn)基因動物的遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，并能穩(wěn)定地遺傳給后代，外源基因不僅能在轉(zhuǎn)基因動物得到整合和表達，而且能獲得組織特異性（乳腺組織）和發(fā)育特性（妊娠后期和泌乳期）表達，利用這一點能產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因泌乳家畜，還能生產(chǎn)出目前短缺而又十分珍貴的醫(yī)用蛋白。近十年，這方面的研究在英、美、法、瑞士和荷蘭等國家已相繼展開，并取得了一定進展。截至目前，世界一些國家的生物技術(shù)企業(yè)在利用轉(zhuǎn)基因動物作生物反應(yīng)器研究開發(fā)的轉(zhuǎn)基因動物藥品有以下幾種。
組織纖溶酶原激活劑（TPA）：由美國遺傳技術(shù)公司（Genentech) 用基因重組技術(shù)開發(fā)的血栓溶解劑，1987 年11 月經(jīng)聯(lián)邦食品及藥物管理局（FDA）批準上市。1988 年的銷售額為1.5 ～ 1.6 億美元，1989年為1.8 ～ 1.9 億美元。今后每年的市場銷售額約為2 ～ 2.5 億美元。
乳鐵蛋白（lactoferrin): 用轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)。由于以轉(zhuǎn)基因奶牛生產(chǎn)乳鐵蛋具備產(chǎn)量高、成本低，以及有無限量增殖生化反應(yīng)器等特征，因而備受各國矚目。乳鐵蛋白是一種口服的活性蛋白，自然產(chǎn)生于人乳中，它具有抗菌、傳遞鐵素等特性。
人類-1 抗胰蛋白酶（AAT）：-1 抗胰蛋白酶（AAT）缺乏是最常見的遺傳代謝病，能引起肺和肝的損傷。-1 抗胰蛋白酶（AAT）為呼吸系統(tǒng)的非特異性可溶因子，它可抑制多種酶的活性，包括細菌的酶，以及中性白細胞溶酶體分泌的蛋白質(zhì)、彈性蛋白酶、膠原酶、纖維蛋白溶酶和凝血酶。這項產(chǎn)品是從英國農(nóng)業(yè)和食品研究委員會的動物生理和遺傳研究院（IAPGR）研究成果為基礎(chǔ)，近年由英國PPL 公司與德國拜耳公司共同嘗試用轉(zhuǎn)基因綿羊的羊奶生產(chǎn)AAT。
促紅細胞生成素(EPO）：以轉(zhuǎn)基因豬生產(chǎn)。這種藥物存于轉(zhuǎn)基因豬的血液中。目前轉(zhuǎn)基因豬血球素合成的遺傳控制機制已十分清楚，用基因重組技術(shù)合成的EPO 已在多個國家上市。
重組人抗凝血酶ii（i atryn）：世界上第一個動物乳腺生物反映器重組蛋白藥物。Atryn的主要成分-重組人抗凝血酶iii 具有抑制血液中凝血酶活性，預(yù)防和治療急慢性血栓血塞形成，對治療抗凝血酶缺失癥有顯著效果。拒美國權(quán)威機構(gòu)預(yù)測，到2010年，轉(zhuǎn)基因動物生產(chǎn)的重組蛋白產(chǎn)品銷售額將達到350 億美元，生產(chǎn)的藥物將占整個基因工程藥物種類的90%以上。
存在的問題與發(fā)展前景
轉(zhuǎn)基因動物與生物反應(yīng)器是20 世紀生命科學(xué)發(fā)展的一個里程碑，但現(xiàn)在仍然存在著許多急需解決的問題。由于轉(zhuǎn)基因動物的研究在理論和技術(shù)上尚有不完善之處，使得轉(zhuǎn)入的外源基因在動物基因組中隨機整合、調(diào)節(jié)失控、遺傳不穩(wěn)定，表達率不高。要提高轉(zhuǎn)基因的效率，保證外源基因的有效表達，關(guān)鍵是基因構(gòu)建的定點整合。轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的產(chǎn)品的安全性問題。這包括轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)物的分離和提純，表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和生物活性與人體蛋白的相似性的問題。只有從表達產(chǎn)物除去能引起人類變態(tài)反應(yīng)的非人類蛋白，并且產(chǎn)品與人體蛋白有足夠的相似性，才能應(yīng)用于人類的健康事業(yè)。轉(zhuǎn)基因動物的成活率低，出生后的部分個體表現(xiàn)出各種生理和免疫缺陷。如為提高生產(chǎn)性能而制備的轉(zhuǎn)基因豬出現(xiàn)了雌性不育、胃潰瘍和關(guān)節(jié)炎等病癥；而克隆牛已經(jīng)先后死去；轉(zhuǎn)基因后獲得的目的性狀，通過有性繁殖后，遺傳性狀出現(xiàn)分離，如英國的一只高產(chǎn)1-AT 羊奶的轉(zhuǎn)基因綿羊，其子代羊奶中的含僅為其母親的1/10[6]。盡管轉(zhuǎn)基因動物生物反應(yīng)器的研究仍面臨著許多需要解決的問題，但它
潛在的社會價值是無可估量的。在未來幾年內(nèi)，將有多種動物乳腺生物反映器重組蛋白上市，從而形成市場前景廣闊和利潤巨大的新生物制藥行業(yè)。
工程
生物反應(yīng)器是使生物反應(yīng)得以實現(xiàn)的裝置。生物反應(yīng)器有各種各樣的形式，要使生物反應(yīng)器運行得好，必須首先對生物反應(yīng)器和反應(yīng)特征有深刻的理解，這就是生物反應(yīng)器工程的概念。生物反應(yīng)器工程著重研究生物反應(yīng)器本身的特性，如其結(jié)構(gòu)和操作方式、操作條件對細胞形態(tài)、生長、產(chǎn)物形成的關(guān)系。它與生物反應(yīng)工程結(jié)合，共同解決各種生物反應(yīng)的最佳生物反應(yīng)器、最佳操作條件的選擇問題。
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