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血藍(lán)蛋白
基本信息
| 中文名 | 血藍(lán)蛋白 |
| 外文名 | hemocyanin，haemocyanin |
介紹
它是在某些軟體動物、節(jié)肢動物(蜘蛛和甲殼蟲）的血淋巴中發(fā)現(xiàn)的一種游離的藍(lán)色呼吸色素。血藍(lán)蛋白含兩個直接連接多肽鏈的銅離子，與含鐵的血紅蛋白類似，它易于氧結(jié)合，也易與氧解離，是已知的惟一可與氧可逆結(jié)合的銅蛋白，氧化時呈青綠色，還原時呈白色。其分子量450000～1300000。節(jié)肢動物的血藍(lán)蛋白一條多肽鏈與一分子氧結(jié)合，含銅量0．17%；軟體動物的血藍(lán)蛋白一條多肽鏈則與6分子氧結(jié)合，含銅量0.025%。銅以二價形式與蛋白直接結(jié)合。血藍(lán)蛋白有多種催化作用，特別是變性后，在特定條件下具有多酚氧化酶、過氧化氫酶和脂氧化酶等活性。
在一些無脊椎動物中，多數(shù)動物的血液不含血紅蛋白，如軟體動物（頭足動物和石鱉屬等）以及節(jié)肢動物（蝦、蟹及肢口綱的鱟）所含的是血藍(lán)蛋白（亦稱為血藍(lán)素）。血藍(lán)蛋白分子由Cu2+和1個約200個以上氨基酸的肽鏈結(jié)合而成，和血紅蛋白一樣，該呼吸色素的顏色也與其狀態(tài)有關(guān)，在氧和狀態(tài)下為藍(lán)色，在非氧和狀態(tài)下則為無色或白色。
關(guān)鍵詞：載氧功能；抗病毒活性；抗菌活性；凝血功能。
血藍(lán)蛋白是節(jié)肢動物和軟體動物血淋巴中的含銅呼吸蛋白，脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧狀態(tài)為藍(lán)色。分子質(zhì)量一般為50ku～75ku，由7個或8個功能單位組成圓柱形結(jié)構(gòu)。組成血藍(lán)蛋白的亞單位數(shù)目較多，每個亞單位都含有2個Cu(Ⅰ）離子。不同蛋白質(zhì)所含亞單位數(shù)目不同，有些血藍(lán)蛋白的分子質(zhì)量可達(dá)9×103ku。軟體血藍(lán)蛋白是圓柱狀分子，含有10個～20個亞單位，每個亞單位（分子質(zhì)量為350ku～450ku）有7個～8個功能單元（氧分子結(jié)合部位）。節(jié)肢動物血藍(lán)蛋白由六聚體或多個六聚體組成，分子質(zhì)量約為3.5×103ku，每個亞單位（分子質(zhì)量為7.5ku）含有一個氧合中心。血藍(lán)蛋白的主要生物學(xué)功能與機(jī)體內(nèi)的輸氧有關(guān)，它與血紅蛋白（hemoglobins）和蚯蚓血紅蛋白（hemerythreins）并稱為動物界中的3種呼吸蛋白。但近年的研究表明，血藍(lán)蛋白是一種多功能蛋白，它不僅具有輸氧功能，而且還與能量的貯存、滲透壓的維持及蛻皮過程的調(diào)節(jié)有關(guān)。特別引起學(xué)術(shù)界重視的是，血藍(lán)蛋白還具有酚氧化物酶活性和抗菌功能，被認(rèn)為是節(jié)肢動物和軟體動物中的一種重要的免疫分子。
結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
血藍(lán)蛋白是蝦血淋巴中的含銅呼吸蛋白，每個氧結(jié)合位點(diǎn)有2個銅原子，其氧的結(jié)合位點(diǎn)與另一種銅離子結(jié)合蛋白——酚氧化酶的氧結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)構(gòu)具有很高的相似性。血藍(lán)蛋白在脫氧狀態(tài)為無色，結(jié)合氧為藍(lán)色。
柱結(jié)合聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）及電鏡技術(shù)，研究中國鱟魚血藍(lán)蛋白（hemocyanin）的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，結(jié)果表明經(jīng)Sephadex G100純化的血藍(lán)蛋白在PAGE電泳中出現(xiàn)4個條帶]，純化的血藍(lán)蛋白再經(jīng)DEAE32層析得到5個洗脫峰，每個峰在PAGE電泳下可分辨出4個條帶，電鏡下，血藍(lán)蛋白分子出現(xiàn)環(huán)形、五角形、十字形和蝴蝶結(jié)形等構(gòu)型并與其他解離的中間的構(gòu)型同時存在。
節(jié)肢動物門的螯肢類、甲殼類、多足類和蜘蛛中都含有血藍(lán)蛋白，其中最大的類群昆蟲雖不存在血藍(lán)蛋白，但含有與血藍(lán)蛋白有同源關(guān)系的六聚蛋白（hexamer）。六聚蛋白又分為富含芳香族氨基酸的和富含甲硫氨基酸的兩個類群。在節(jié)肢動物的近親有爪類（Onychophora）中也發(fā)現(xiàn)了節(jié)肢動物類型的血藍(lán)蛋白。節(jié)肢動物類型的血藍(lán)蛋白有四級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。血藍(lán)蛋白的三級結(jié)構(gòu)，分子質(zhì)量約為75ku，其中第2個域?yàn)棣谅菪齾^(qū)，螯合1對Cu+，可結(jié)合1個O2，下方為第3個域，由β折疊塊構(gòu)成并含有Ca離子，功能尚不詳。
節(jié)肢動物血藍(lán)蛋白至少已分化成為：①酚氧化酶原（prophenoloxidase）；②昆蟲的六聚蛋白（hexamer），不螯合Cu+，為貯藏蛋白；③甲殼類的假血藍(lán)蛋白（pseudohemocyanin或cryptocyanin），也為貯藏蛋白；④雙翅類的六聚蛋白受體。經(jīng)分子系統(tǒng)學(xué)的分析，它們與血藍(lán)蛋白相聚，共同構(gòu)建了節(jié)肢動物血藍(lán)蛋白基因超家族。
功能
載氧功能
血藍(lán)蛋白是以一價銅離子作為輔基的蛋白質(zhì)。它存在于軟體動物（如章魚、烏賊、蝸牛等）和節(jié)足動物（如螃蟹、蝦、蜘蛛等）的血液里。血藍(lán)蛋白的生理功能是輸氧。氧合血藍(lán)蛋白的銅是Cu（Ⅱ）并呈藍(lán)色，在347nm附近有吸收峰，這是由扭曲四面體場中的dd躍進(jìn)產(chǎn)生的。脫氧血藍(lán)蛋白呈無色。X射線衍射技術(shù)大大增加了人們對血藍(lán)蛋白的認(rèn)識。雖然目前仍未測出軟體血藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但為節(jié)肢動物血藍(lán)蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析提供了血藍(lán)蛋白分子活性部位的結(jié)構(gòu)信息。龍蝦血藍(lán)蛋白亞單位由3個結(jié)構(gòu)區(qū)域組成。區(qū)域Ⅰ為蛋白的前175個氨基酸殘基組，有大量的α螺旋二級結(jié)構(gòu)；區(qū)域Ⅱ大部分也為α螺旋二級結(jié)構(gòu)，由225個氨基酸殘基（176個～400個）和作氧分子鍵合部位的雙銅離子組成；剩余的258個氨基酸殘基（401個～658個）構(gòu)成區(qū)域Ⅲ，并且類似于如超氧化物歧化酶等其他蛋白的β折疊二級結(jié)構(gòu)。在區(qū)域Ⅱ的雙銅活性中心中，每個銅離子與3個組氨酸殘基的咪唑氮配位。未氧合時，2個銅離子相距約46pm，相互作用很弱，沒有發(fā)現(xiàn)2個銅離子之間存在著蛋白質(zhì)本身提供的橋基。此時，每個銅離子與3個組氨酸殘基咪唑氮的配位基本上是三角形幾何構(gòu)型。氧合后，Cu（Ⅱ）為四配位或五配位，兩個銅離子與兩個氧原子（過氧陰離子）和6個組氨酸殘基中最靠近銅離子的4個組氨基酸殘基咪唑氮強(qiáng)配位。此時，在一個近似的平面上，每個銅離子呈平面正方形幾何構(gòu)型，這是Cu（Ⅱ）最有利的配位狀況。氧分子以過氧橋形式在連接兩個Cu（Ⅱ），兩個Cu（Ⅱ）相距約36pm。
化學(xué)家對合成血藍(lán)蛋白的模型化合物頗感興趣。1978年Simmons M G和Wilson L J合成了以咪唑作為配體的Cu（Ⅰ）配合物，在室溫下無論是溶液或固體都能可逆載氧。用2，6二乙?；?/a>吡啶與組胺縮合，得到配體2，6[1；（2；咪唑4亞乙基亞氨基）乙基]吡啶，然后在氮?dú)?/a>保護(hù)下加入[Cu（Ⅰ）（MeCN)4](ClO4）得到暗紅色的[Cu（Ⅰ）](ClO4）配合物。
該配合物在溶液中以單體形式存在。Cu（Ⅰ）離子的配位數(shù)為5。在室溫下露置于空氣中，溶液迅速從紅色變?yōu)榫G色，約2min后反應(yīng)完全，每2 mol Cu（Ⅰ）吸收1 mol O2。如果把載氧后的溶液溫?zé)嶂?0℃左右并用氮?dú)廒s跑氣體，或在減壓下攪拌溶液，很容易發(fā)生放氧逆反應(yīng)，溶液恢復(fù)原來的紅色。如此重復(fù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)它能可逆載氧。據(jù)此推測可能存在下列反應(yīng)LCuⅠ+O2??LCuⅡO LCuⅡO + CuIL??LCuⅡO CuⅡL。
抗病毒作用
血藍(lán)蛋白具有非特異性抗病毒作用。應(yīng)用親和層析從斑節(jié)對蝦(Penaeus monodon）血清中分離出2種能與白斑桿狀病毒（White spot syndrome virus ，WSSV）和虹彩病毒(Singapore grouper irido virus，SGⅣ）結(jié)合的多肽，分子質(zhì)量分別為73 ku和75 ku，經(jīng)質(zhì)譜分析鑒定為血藍(lán)蛋白，將血藍(lán)蛋白和病毒混合后添加到細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞只受到較輕微的破損。而不含血藍(lán)蛋白的對照組細(xì)胞則完全裂解。如果延長培養(yǎng)時間，試驗(yàn)組細(xì)胞也相繼裂解。隨后選用6種DNA 或RNA病毒（SGⅣ、FV3、LDV、ThRV、ABV和IPNV）進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其半抑制濃度（Semiinhibitory concentration，ECs）約為4.56 mg/L～6.64 mg/L。這些結(jié)果表明，血藍(lán)蛋白在低濃度時是潛在的病毒抑制物，但血藍(lán)蛋白不能完全抑制病毒的復(fù)制。
研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白的兩個亞基在免疫功能上有很大差異，Lei K Y等報道，血藍(lán)蛋白的兩個分子質(zhì)量73ku和75ku的亞基，只有75ku的PjHcL亞基具有抗病毒功能，PjHcY亞基不具有抗病毒功能，它意味著這兩個血亞基可能起不同的角色。從序列和結(jié)構(gòu)的比較發(fā)現(xiàn)，盡管這兩個亞基是高度保守的，它們表現(xiàn)出一定的差異在N端域和C端域。比對兩個亞基的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在銅離子結(jié)合位點(diǎn)及第2功能區(qū)兩個亞基結(jié)構(gòu)完全相同，只有在第3功能區(qū)PjHcL亞基和PjHcY亞基的氨基酸α、β構(gòu)型不同。Lei等采用RTPCR技術(shù)精確驗(yàn)證了這一結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)了兩個亞基的不同免疫功能，為以后研究血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)功能提供了更明確的依據(jù)。
總之，血藍(lán)蛋白的免疫防御功能是近年來無脊椎動物免疫學(xué)領(lǐng)域的最新發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)中，僅可表現(xiàn)出酚氧化酶的功能，而且可裂解產(chǎn)生不同分子質(zhì)量大小的抗菌片段以抵御病原的入侵。雖然其免疫機(jī)理目前尚不十分明確，但隨著無脊椎動物上的演變相信其確實(shí)情況必將闡明。
凝集作用
近年來國內(nèi)外研究表明，血藍(lán)蛋白及其裂解片段具有多種免疫功能。章躍陵以采自汕頭的南美白對蝦為研究對象，采用親和層析、PAGE、SDSPAGE、Western blot、血細(xì)胞凝集試驗(yàn)和糖抑制試驗(yàn)等方法探索南美白對蝦血藍(lán)蛋白的血細(xì)胞凝集活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白對試驗(yàn)所選用的魚、雞、鼠和人等4種紅細(xì)胞均具有顯著的血細(xì)胞凝集活性，凝集活性大小為5 mg/L～10 mg/L，而且其凝集反應(yīng)可被α；半乳糖、αD葡萄糖、甘露醇和N乙酰神經(jīng)氨酸等4種糖所顯著抑制。不過，與一般的凝集素相比，血藍(lán)蛋白的凝集活性大概低1個～2個數(shù)量級，它在蝦血清中含量上的豐富也許可以彌補(bǔ)其凝集活性上的不足。既往研究中，發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白蛋白斑點(diǎn)的肽質(zhì)量譜峰值可以與流感病毒的血凝素相匹配，其序列覆蓋率為37%。由此推測，血藍(lán)蛋白確實(shí)具有血細(xì)胞凝集活性，這對進(jìn)一步研究血藍(lán)蛋白的免疫學(xué)功能具有重要意義。
研究證實(shí)，血藍(lán)蛋白可能由酚氧化酶進(jìn)化而來，酚氧化酶級聯(lián)系統(tǒng)的激活又與甲殼動物體內(nèi)凝血蛋白的凝血機(jī)制緊密相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)血藍(lán)蛋白也具有凝集活性。這些研究結(jié)果提示，血藍(lán)蛋白、酚氧化酶及凝血蛋白可能是由同一蛋白進(jìn)化而來，而血藍(lán)蛋白這一多功能分子卻保留了它們?nèi)康拿庖邔W(xué)功能。
抗菌作用
血藍(lán)蛋白裂解產(chǎn)生的抗微生物肽與對蝦的免疫反應(yīng)有關(guān)。近來又在大西洋白對蝦和凡納對蝦的血淋巴中分離到3種帶負(fù)電荷的抗真菌活性肽類，與血藍(lán)蛋白C端序列的一致性達(dá)95%～100%。當(dāng)對蝦被感染后，血淋巴中這種血藍(lán)蛋白C端序列的活性肽濃度升高，這表明血藍(lán)蛋白的裂解是由生物學(xué)信號引起的。Lee S Y等從淡水螯蝦血漿中得到一種由16個氨基組成的抗菌肽，能抑制G+和G－細(xì)菌的生長。這種抗菌肽是血藍(lán)蛋白在酸性條件下經(jīng)蛋白酶剪切產(chǎn)生。注射脂多糖和葡聚糖可促進(jìn)血藍(lán)蛋白產(chǎn)生和釋放這種肽。這說明抗微生物肽可以被誘導(dǎo)、釋放和激活，從而在肌體的免疫防御中起作用。Zhang Y L等還在凡納對蝦血清中分離到一種能與羊抗人IgG特異性反應(yīng)的IgG樣蛋白，經(jīng)檢測為血藍(lán)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，除銅結(jié)合位點(diǎn)外，在此血藍(lán)蛋白的C端還存在一個由252個氨基酸組成的似Ig的保守區(qū)域。此外，還在血藍(lán)蛋白和Ig的重鏈和k鏈分別發(fā)現(xiàn)4個和1個相似保守區(qū)域。很有可能這些相似Ig的保守區(qū)域賦予了甲殼動物呼吸色素新的功能，使其更好地發(fā)揮抗微生物作用。雖然到目前為止，血藍(lán)蛋白的加工機(jī)制還不十分清楚，但它們在甲殼動物免疫系統(tǒng)中所起的作用不容忽視，因此進(jìn)行深入細(xì)致的研究，搞清楚其免疫機(jī)制，對于甲殼類經(jīng)濟(jì)動物的疾病控制是至關(guān)重要的。
近年來，隨著血藍(lán)蛋白多種功能的不斷發(fā)現(xiàn)，特別是免疫活性的發(fā)現(xiàn)，血藍(lán)蛋白的功能、作用機(jī)理、進(jìn)化地位已經(jīng)引起各國學(xué)者的濃厚興趣。進(jìn)一步研究血藍(lán)蛋白功能對于豐富和發(fā)展無脊椎動物，特別是甲殼類動物生理生化和免疫系統(tǒng)的基礎(chǔ)研究，探索免疫這些結(jié)果表明，血藍(lán)蛋白具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒功能及獨(dú)特的作用機(jī)理，有可能成為抗菌、抗病毒及抗腫瘤藥物的新來源。中國是海洋大國，開發(fā)和利用海洋動物血藍(lán)蛋白資源，將為研制抗菌新藥提供理想分子設(shè)計骨架和模板，為發(fā)展新的抗感染藥物奠定重要基礎(chǔ)。此外，蝦類血藍(lán)蛋白的研究加深了人們對低等脊椎動物免疫防御機(jī)制的認(rèn)識，為日益嚴(yán)重的蝦類病害防治開辟了嶄新的途徑。同時，隨著蝦類轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，人們有可能通過轉(zhuǎn)血藍(lán)蛋白基因獲得抗病新品種?？梢韵嘈?，隨著研究的不斷深入，蝦類血藍(lán)蛋白將對世界水產(chǎn)漁業(yè)的可持續(xù)發(fā)展起到重要的作用。
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