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凝集素
從動(dòng)植物中提純的糖蛋白
簡(jiǎn)介
凝集素是動(dòng)物細(xì)胞和植物細(xì)胞都能夠合成和分泌的、能與糖結(jié)木菠蘿凝集素合的蛋白質(zhì),在細(xì)胞識(shí)別和粘著反應(yīng)中起重要作用,主要是促進(jìn)細(xì)胞間的粘著。凝集素具有一個(gè)以上同糖結(jié)合的位點(diǎn)，因此能夠參與細(xì)胞的識(shí)別和粘著,將不同的細(xì)胞聯(lián)系起來。
其常見種類見表6-1。常用的為植物凝集素（Phytoagglutin, PNA），通常以其被提取的植物命名，如刀豆素A（Conconvalina,ConA）、麥胚素（Wheat germ agglutinin, WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin, PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin, SBA）等，凝集素是它們的總稱。凝集素不是來源或參與免疫反應(yīng)的產(chǎn)物，凝集素具有的某些“親合”特性，能被免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)方法所應(yīng)用。因此，Ponder（1983）提出應(yīng)稱“凝集素組織化學(xué)”而不能稱為“凝集素免疫組織化學(xué)”。
雖然人們認(rèn)為在植物中凝集素的功能是結(jié)合細(xì)胞表面上的糖蛋白，然而在動(dòng)物中它的功能也包括結(jié)合可溶性的細(xì)胞外或細(xì)胞內(nèi)糖蛋白。舉例來說，有一種凝集素被發(fā)現(xiàn)在哺乳類動(dòng)物肝細(xì)胞的表面上，能夠?qū)Ｒ恍缘淖R(shí)別乳糖殘基。人們相信這些細(xì)胞表面上的接受器是負(fù)責(zé)將循環(huán)系統(tǒng)中的特定糖蛋白移除。另一個(gè)例子是甘露糖-6-磷酸接受器能夠識(shí)別含有此種殘基的水解酵素，隨后標(biāo)定這些蛋白將其送至溶小體。它們提供許多不同的生物功能——從細(xì)胞附著的調(diào)控，到糖蛋白合成，以及血液中蛋白質(zhì)的濃度。凝集素也能夠借由識(shí)別僅在病原中發(fā)現(xiàn)或是無法進(jìn)入宿主細(xì)胞的的糖類而在免疫系統(tǒng)中扮演重要的角色。
植物凝集素
植物凝集素是來源于植物的一類能凝集細(xì)胞和沉淀單糖或多糖復(fù)合物的非免疫來源的非酶蛋白質(zhì)。由于其對(duì)于單糖或糖復(fù)合物特異性結(jié)合的能力，使得其在如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫反應(yīng)、植物防御等諸多信號(hào)過程中均具有重要作用。同時(shí)植物凝集素具有細(xì)胞凝集、抗病毒、抗真菌及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或自噬等多種能力，因此在生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)方面均有較好的研究?jī)r(jià)值和應(yīng)用前景。
凝集素是指非免疫來源的糖結(jié)合蛋白或糖蛋白，并應(yīng)有使細(xì)胞凝集或糖復(fù)合物沉淀的能力。此定義包含三個(gè)要點(diǎn)：(1)凝集素是蛋白質(zhì)或糖蛋白；(2) 凝集素必須有專一的與糖基結(jié)合的特性，但是排除了免疫來源的針對(duì)糖基的抗體；(3) 因?yàn)橐?guī)定了能使細(xì)胞凝集或是糖復(fù)合物沉淀的特性，所以凝集素分子必須具有兩個(gè)或更多糖結(jié)合位點(diǎn)，這樣把一些雖有糖結(jié)合能力但是糖結(jié)合位點(diǎn)僅有一個(gè)的酶、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、激素、毒素等排除在外。凝集素可以識(shí)別糖蛋白和糖脂中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，也識(shí)別細(xì)胞膜表面的糖基，因此，凝集素可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的有利工具。此外，凝集素由于具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合而不影響其生物活性，因此，凝集素也可用于免疫細(xì)胞化學(xué)的研究，以及腫瘤的診斷評(píng)價(jià)等。凝集素蛋白至少包含一個(gè)可以結(jié)合碳水化合物的結(jié)構(gòu)域，基于此，凝集素可以被分成主要的四類，部分凝集素(merolectins)、全凝集素 (hololectins)、超凝集素 (superlectin)以及嵌合凝集素 (chimerolectins)。
純化的凝集素對(duì)于臨床應(yīng)用非常重要，因?yàn)樗軌蛴脕龛b定血型。有些存在人類紅血球上的糖脂質(zhì)以及糖蛋白能夠經(jīng)通過凝集素來鑒定。一種來自于雙花扁豆（Dolichos biflorus）的凝集素，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)可識(shí)別A1血型。來自于植物Ulex europaeus（重瓣刺金雀/荊豆/烏樂樹）的凝集素，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)可識(shí)別H血型抗原，而來自于植物Vicia gramineae（野豌豆屬禾本科）的凝集素則可識(shí)別N血型抗原。
凝集素在植物中的真正功能還有待研究，而是否僅具細(xì)胞附著功能依然還有疑問。凝集素在種子中大量表現(xiàn)（通常自種子中純化），并且隨著植物生長(zhǎng)而減少，這顯示其在植物發(fā)芽或種子自我生存中扮演了重要角色。
凝集素被視為免疫系統(tǒng)中的直接演化前身，而且它們至今依然在此扮演重要角色 - 凝集素補(bǔ)體激活途徑、甘露糖結(jié)合凝集素、S、P、E凝集素,等等。
豆科植物中的凝集素已被廣泛的作為模式生物來了解蛋白質(zhì)如何識(shí)別糖類的分子基礎(chǔ)，因?yàn)樗鼈兿鄬?duì)容易取得而且具有廣泛的糖類種類。許多凝集素的晶體結(jié)構(gòu)也揭示了糖類與蛋白質(zhì)之間的原子作用。
應(yīng)用
一般認(rèn)為細(xì)胞膜上特定的糖基可用以區(qū)別細(xì)胞的類型和反映細(xì)胞在分化、成熟和腫瘤細(xì)胞性變中的變化。僅在某些特殊的例子，其細(xì)胞結(jié)合凝集素的性能可以預(yù)先估計(jì)，如雙花扁豆素之于血型A物質(zhì)的特異性，荊豆凝集素之于血型O物質(zhì)2—L—巖藻糖的特異性，然而在絕大多數(shù)情況下，關(guān)于由凝集素所識(shí)別的碳水化合物決定簇的種類，關(guān)于攜帶決定簇的分子的性質(zhì)和機(jī)能，完全憑實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)去發(fā)現(xiàn)。
細(xì)胞分化標(biāo)志：
作為細(xì)胞分化和成熟的標(biāo)記 應(yīng)用凝集素作為細(xì)胞分化的標(biāo)志，在這方面的應(yīng)用報(bào)告最多，而且研究比較集中于血細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞的分群。如Rose（1980）等發(fā)現(xiàn)在小鼠胸腺皮質(zhì)內(nèi)不成熟的T淋巴細(xì)胞呈PNA陽性反應(yīng)，在小鼠小腸集合淋巴小結(jié)的生發(fā)中心也發(fā)現(xiàn)有20%左右的PNA陽性反應(yīng)細(xì)胞，后者是否屬于不成熟的T淋巴細(xì)胞，是值得進(jìn)一步研究的問題。Newman等（1979）以熒光素標(biāo)記凝集素PNA，發(fā)現(xiàn)在大鼠乳腺上皮的不同分化時(shí)期顯示不同的熒光強(qiáng)度。在不成熟的大鼠乳腺上皮細(xì)胞，熒光弱或無，隨著性成熟期到妊娠期乳腺上皮熒光程度逐漸加強(qiáng)，而泌乳期熒光強(qiáng)度達(dá)最高峰。在皮膚角質(zhì)細(xì)胞自基底向表層分化、成熟的過程中，細(xì)胞表面的碳水化合物的分布和性質(zhì)都在改變。Brabed等（1981）應(yīng)用新生大鼠皮膚的實(shí)驗(yàn)表明，皮膚各層細(xì)胞分別與不同的凝集素相結(jié)合。麥芽素與角質(zhì)化細(xì)胞相結(jié)合，蓖麻素與棘細(xì)胞和基底細(xì)胞相結(jié)合，而荊豆凝集素標(biāo)記在棘細(xì)胞的表面。在成肌細(xì)胞（myeoblast）的分化與成熟過程中，Winaod 和Luzzati（1975）注意到類似的皮膚的改變。
細(xì)胞特殊類型標(biāo)記：
凝集素
管內(nèi)皮細(xì)胞上，電鏡觀察顯示DBA結(jié)合在內(nèi)皮細(xì)胞的表面，在趣的是在RIII品系小鼠某些組織的內(nèi)皮細(xì)胞顯示肯定的DBA陰性反應(yīng)，說明同一種屬動(dòng)物的血管內(nèi)皮細(xì)胞也存在有組織特異性的差別。Streit和Kreutzberg（1987）發(fā)現(xiàn)Griffonia Simplicifolia凝集素特異性標(biāo)記面神經(jīng)節(jié)內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，其它類型的膠質(zhì)細(xì)胞如星狀膠質(zhì)細(xì)胞（astrocyte）等都顯示陰性反應(yīng)。在切斷面神經(jīng)后，增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Griffonia Simplicifolia凝集素的反應(yīng)加強(qiáng)，免疫電鏡觀察表明，凝集素主要沉積在細(xì)胞膜或小膠質(zhì)細(xì)胞突起的軸膜表面，特異性結(jié)合糖基是α—D—半乳糖。上海醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院免疫病理室應(yīng)用12種凝集素（表6-1）對(duì)人胚胎及各種正常組織進(jìn)行了系統(tǒng)的凝集素受體的定位研究，結(jié)果表明，凝集素受體的分布并無即定規(guī)律可尋。如胃粘膜主細(xì)胞為PNA受體，而壁細(xì)胞為BSL受體，雙花扁豆受體（DBA）主要出現(xiàn)在大腸部份。
伴有細(xì)胞膜的改變：
在腫瘤中凝集素結(jié)合的改變 腫瘤細(xì)胞伴有細(xì)胞膜的改變，細(xì)胞膜上的糖基也會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的變化，可用凝集素檢測(cè)出來。大量研究發(fā)現(xiàn)，凝集素可作為腫瘤組織源性的標(biāo)記、腫瘤特異性診斷的標(biāo)志、腫瘤惡性的標(biāo)記和不同腫瘤的分化標(biāo)記。如張華忠等（1987）報(bào)道115例胃癌標(biāo)記PHA陽性率高達(dá)90.43%，而正常胃粘膜基本是陰性，故認(rèn)為PHA是胃癌的診斷性標(biāo)志。BSA對(duì)乳腺惡性腫瘤陽性率達(dá)79%，而對(duì)良性病變均呈陰性反應(yīng)，提示BSA可能為乳腺惡性腫瘤的相關(guān)標(biāo)志。凝集素還有助于判別腫瘤的組織類型，如神經(jīng)系統(tǒng)星形細(xì)胞瘤ConA陽性，小膠質(zhì)細(xì)胞瘤陰性，腎腺癌UEA1陰性，透明細(xì)胞癌陽性。
化學(xué)應(yīng)用
凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標(biāo)記，分別進(jìn)行下列染色法：
直接法
標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。
（1）切片脫蠟至水。
（2）凝集素標(biāo)記物（100μg/ml），室溫，30min。
（3）TBS洗3次，每次2min。
（4）如為熒光素標(biāo)記物，封片用熒光顯微鏡觀察。如為酶標(biāo)記物，則應(yīng)依次進(jìn)行呈色、脫水、透明和封固后在光學(xué)顯微下觀察。
直接法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)便，商品用的凝集素藥盒已能購(gòu)得。但靈敏性不夠高。
間接法
凝集素受體表達(dá)
抗體上。
（1）脫蠟至水。
（3）凝集素稀釋液（100μg/ml）孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次2min。
（5）用標(biāo)記了的抗凝集素抗體（1：100）孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次2min。
（7）呈色、脫水、透明、封片。
（8）觀察。
間接法染色還可進(jìn)一步改良為：①三步法：即在凝集素孵育后，接著用抗凝集素抗體孵育，再用標(biāo)記了的抗-抗凝集素抗體孵育，層層放大，進(jìn)一步提高其敏感性，PAP復(fù)合物也可作為標(biāo)記物標(biāo)記在抗-抗凝集素抗體上。②抗生物素—生物素凝集素法：用結(jié)合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—標(biāo)記物與之結(jié)合。間接法較直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必須購(gòu)買或自制抗凝集素抗體。
糖—凝集素—糖法：
本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，將這些部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖—凝集素—糖的結(jié)合物。
（1）脫蠟至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10min。
（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次3min。
（6）TBS洗3次，每次3min。
（7）DAB呈色、脫水、透明、封固。
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