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紫外－可見分光光度法
鑒別、檢查和測定雜質(zhì)的方法
紫外-可見分光光度法是在190～800nm波長范圍內(nèi)測定物質(zhì)的吸光度，用于鑒別、雜質(zhì)檢查和定量測定的方法。當光穿過被測物質(zhì)溶液時，物質(zhì)對光的吸收程度隨光的波長不同而變化。因此，通過測定物質(zhì)在不同波長處的吸光度，并繪制其吸光度與波長的關系圖即得被測物質(zhì)的吸收光譜。從吸收光譜中，可以確定最大吸收波長λmax和最小吸收波長λmin。物質(zhì)的吸收光譜具有與其結構相關的特征性。因此，可以通過特定波長范圍內(nèi)樣品的光譜與對照光譜或?qū)φ掌饭庾V的比較，或通過確定最大吸收波長，或通過測量兩個特定波長處的吸收比值而鑒別物質(zhì)。用于定量時，在最大吸收波長處測量一定濃度樣品溶液的吸光度，并與一定濃度的對照溶液的吸光度進行比較或采用吸收系數(shù)法求算出樣品溶液的濃度。
基本信息
| 中文名 | 紫外-可見分光光度法 |
| 外文名 | ultraviolet&visible spectrophotpmetry |
| 特點 | 操作簡單、準確度高 |
| 組成部分 | 輻射源、單色器等 |
| 性質(zhì) | |
| 簡稱 | UV-Vis |
收起
原理或術語
光譜法（spectrometry）是基于物質(zhì)與電磁輻射作用時，測量由物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級之間的躍遷而產(chǎn)生的發(fā)射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。光譜法可分為發(fā)射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動、轉動光譜，電子自旋及核自旋譜等。
分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的吸光度或發(fā)光強度，對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法。常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。
常用檢測儀器：紫外-可見分光光度計。
原理如下：
單色光輻射穿過被測物質(zhì)溶液時，在一定的濃度范圍內(nèi)被該物質(zhì)吸收的量與該物質(zhì)的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關系可以用朗伯-比爾定律表述如下：
式中
A為吸光度；
T為透光率；
E為吸收系數(shù)，常用的表示方法，其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時的吸光度數(shù)值；
c為100ml溶液中所含物質(zhì)的重量（按干燥品或無水物計算），g；
l（L）為液層厚度，cm。
分光光度計
紫外-可見分光光度計由5個部件組成：①輻射源。必須具有穩(wěn)定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續(xù)光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長范圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調(diào)諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統(tǒng)和色散元件（棱鏡或光柵）組成，是用以產(chǎn)生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產(chǎn)生的復合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用于紫外到可見區(qū)，后者只適用于可見區(qū)。容器的光程一般為0.5～10厘米。④檢測器，又稱光電轉換器。常用的有光電管或光電倍增管，后者較前者更靈敏，特別適用于檢測較弱的輻射。近年來還使用光導攝像管或光電二極管矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點。⑤顯示裝置。這部分裝置發(fā)展較快。較高級的光度計，常備有微處理機、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數(shù)據(jù)和操作條件都顯示出來。
儀器類型則有：單波長單光束直讀式分光光度計，單波長雙光束自動記錄式分光光度計和雙波長雙光束分光光度計。
應用范圍包括：①定量分析，廣泛用于各種物料中微量、超微量和常量的無機和有機物質(zhì)的測定。②定性和結構分析，紫外吸收光譜還可用于推斷空間阻礙效應、氫鍵的強度、互變異構、幾何異構現(xiàn)象等。③反應動力學研究，即研究反應物濃度隨時間而變化的函數(shù)關系，測定反應速度和反應級數(shù)，探討反應機理。④研究溶液平衡，如測定絡合物的組成，穩(wěn)定常數(shù)、酸堿離解常數(shù)等。
儀器校正檢定
1.波長
由于環(huán)境因素對機械部分的影響，儀器的波長經(jīng)常會略有變動，因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應于測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正；鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化，使用時應注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配制含氧化鈥（
）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。
儀器波長的允許誤差為：紫外光區(qū)±1nm，500nm附近±2nm。
2.吸光度的準確度
波長/nm | 235（最?。?/span> | 257（最大） | 313（最?。?/span> | 350（最大） |
吸收系數(shù)( )的規(guī)定值 | 124.5 | 144.0 | 48.6 | 106.6 |
吸收系數(shù)( )的許可范圍 | 123.0～ 126.0 | 142.8～ 146.2 | 47.0～ 50.3 | 105.5～ 108.5 |
3.雜散光的檢查
對溶劑要求
測定法
測定時，除另有規(guī)定外，應以配制供試品溶液的同批溶劑為空白對照，采用1cm的石英吸收池，在規(guī)定的吸收峰波長±2nm以內(nèi)測試幾個點的吸光度，或由儀器在規(guī)定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規(guī)定外，吸收峰波長應在該品種項下規(guī)定的波長±2nm以內(nèi)，并以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數(shù)，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小于供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增大為準，由于吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數(shù)，或由儀器自動扣除空白讀數(shù)后再計算含量。
當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調(diào)成一致。
1.鑒別和檢查分別按各品種項下規(guī)定的方法進行。
2.含量測定一般有以下幾種方法。
（1）對照品比較法
按各品種項下的方法，分別配制供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規(guī)定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規(guī)定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度∶
式中
為供試品溶液的濃度；
（2）吸收系數(shù)法
按各品種項下的方法配制供試品溶液，在規(guī)定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規(guī)定條件下的吸收系數(shù)計算含量。用本法測定時，吸收系數(shù)通常應大于100，并注意儀器的校正和檢定。
（3）計算分光光度法
計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規(guī)定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應盡可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。
（4）比色法
供試品本身在紫外-可見光區(qū)沒有強吸收，或在紫外光區(qū)雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當?shù)?/span>顯色劑，使反應產(chǎn)物的最大吸收移至可見光區(qū)，這種測定方法稱為比色法。
用比色法測定時，應取數(shù)份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，再根據(jù)供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，并求出其含量。
也可取對照品溶液與供試品溶液同時操作，顯色后，以相應的試劑為空白，在各品種規(guī)定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計算供試品溶液的濃度。
除另有規(guī)定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對照品或供試品溶液，然后依次加入等量的相應試劑，并用同樣方法處理制得。
參考資料
[1]
藥物分析法：紫外可見分光光度法 · 醫(yī)學教育網(wǎng)[引用日期2021-07-30]
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