門多薩假單胞菌（門多薩假單胞菌）

用途

利用門多薩假單胞菌NK-01?合成褐藻寡糖

簡介

利用門多薩假單胞菌NK-01發(fā)酵生產(chǎn)褐藻寡糖，并開發(fā)其在醫(yī)藥、食品、飼料、化工和化妝品等行業(yè)的應(yīng)用，生產(chǎn)出大批量有重要價值的下游產(chǎn)品。確立褐藻寡糖的發(fā)酵工藝流程和下游分離提取工藝流程，完成門多薩假單胞菌NK-01發(fā)酵生產(chǎn)褐藻寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定和分子量的表征。為以葡萄糖一步法發(fā)酵生產(chǎn)褐藻寡糖奠定基礎(chǔ)。從土壤中分離到1株能夠合成中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的細(xì)菌,?經(jīng)分類鑒定命名為Pseudomonas?mendocina?NK-01。對于該菌株在氮源限制的情況下,?利用葡萄糖合成的PHAMCL進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析。同時,?獲得了該菌株P(guān)HA合成酶基因phaC1,?利用大腸桿菌表達(dá)載體pBluescript?SK-構(gòu)建了重組載體pBSphaC1,?并在E.coli?JM109中成功表達(dá)。以所構(gòu)建的工程菌株進(jìn)行了發(fā)酵合成。

特征特性

菌落圓形凸起，透明，水滴狀，表面光滑濕潤，邊緣整齊，菌體桿狀0.5*1.0μm,?有莢膜,?格蘭氏陰性。具有自生固氮能力，降解芳香烴。

合成褐藻寡糖及其結(jié)構(gòu)鑒定

研究發(fā)現(xiàn)門多薩假單胞菌NK-01?在菌體內(nèi)積累中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的同時也能夠合成褐藻寡糖分泌到發(fā)酵液中,?其產(chǎn)量與培養(yǎng)基的碳氮比有關(guān),?高碳氮比有利于褐藻寡糖的合成。本研究利用紫外-可見分光光度法、傅立葉紅外光譜分析、1H?和13C?核磁共振對褐藻寡糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析鑒定,?發(fā)現(xiàn)褐藻寡糖的結(jié)構(gòu)是由β-D-甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通過β-(1→4)/?α-(1→4)鍵連接而成的無支化線性多糖,?并且在單體的2?位或3?位羥基上部分乙?；?。凝膠滲透色譜(GPC)對分子量的測定結(jié)果為2054。

褐藻寡糖是褐藻多糖的寡聚物,?是聚合度較小的褐藻多糖。褐藻多糖是由海藻和細(xì)菌合成的一種多糖,?海藻中褐藻多糖主要起骨架作用,?而細(xì)菌中褐藻多糖是細(xì)胞壁的一種成分,?抵制不良的環(huán)境，有些細(xì)菌則將合成的褐藻多糖分泌到細(xì)胞外。褐藻多糖是由β-D?甘露糖醛酸、α-L-古洛糖醛酸通過β-(1→4)/?α-(1→4)鍵連接而成的無支化線性多糖。其中β-D?甘露糖醛酸中的C5?被差向異構(gòu)化即是α-L-古洛糖醛酸。褐藻多糖中有3?種類型的鏈段?(Blockstructure),?其一是完全由β-D?甘露糖醛酸按照β-(1→4)鍵結(jié)合的M-M?型;?二是完全由α-L-古洛糖醛酸按α-(1→4)鍵結(jié)合的G-G型;?三是由β-D?甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸混合交替結(jié)合的M-G?型。來自細(xì)菌的褐藻多糖和來自海藻的褐藻多糖具有相同的基本結(jié)構(gòu),?差別僅在于細(xì)菌褐藻多糖中C2?和/或C3?羥基常常不同程度地被乙?；??乙酰化程度因菌株及生長條件的不同而有明顯的差異。褐藻多糖及其寡聚物已廣泛應(yīng)用于食品、制藥、化工等多個領(lǐng)域,?具有廣闊的開發(fā)前景,?如富含甘露糖醛酸的褐藻多糖和寡糖具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[3-5]。

褐藻寡糖有多種合成方法?；瘜W(xué)合成法主要缺點是需要多重基團(tuán)保護(hù)和去保護(hù)步驟,?產(chǎn)量低,?因而沒有實際的工業(yè)價值。用酶法制備褐藻寡糖,?多是先分離純化得到褐藻寡糖裂解酶后再制備褐藻寡糖系列產(chǎn)物,?但酶的分離純化比較繁瑣,?且在這一過程中酶也容易失活,?酶法合成的價格也比較昂貴。本研究采用門多薩假單胞菌NK-01?合成褐藻寡糖屬于液體發(fā)酵,?工藝簡單,?發(fā)酵周期短,?適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

研究發(fā)現(xiàn)Pseudomonas?mendocina?NK-01?在菌體內(nèi)積累中長鏈聚羥基脂肪酸酯(PHAMCL)的同時，也能夠合成褐藻寡糖分泌到發(fā)酵液中。本研究采用多種分析手段,?對褐藻寡糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。