酶切技術(shù)（限制性內(nèi)切酶切割DNA片斷的技術(shù)）

雙酶切

同步雙酶切

同步雙酶切是一種省時省力的常用方法。選擇能讓兩種酶同時作用的最佳緩沖液是非常重要的一步。NEB每一種酶都隨酶提供相應(yīng)的最佳NEBuffer，以保證100%的酶活性。NEBuffer的組成及內(nèi)切酶在不同緩沖液中的活性見《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》及每支酶的說明書。能在最大程度上保證兩種酶活性的緩沖液即可用于雙酶切。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液條件下的切割速率會減緩，因此使用時可根據(jù)每種酶在非最優(yōu)緩沖液中的具體活性相應(yīng)調(diào)整酶量和反應(yīng)時間。

分步酶切

如果找不到一種可以同時適合兩種酶的緩沖液，就只能采用分步酶切。分步酶切應(yīng)從反應(yīng)要求鹽濃度低的酶開始，酶切完畢后再調(diào)整鹽濃度直至滿足第二種酶的要求，然后加入第二種酶完成雙酶切反應(yīng)。

使用特殊酶進行雙酶切

使用配有特殊緩沖液的酶進行雙酶切也不復(fù)雜。在大多數(shù)情況下，采用標準緩沖液的酶也能在這些特殊緩沖液中進行酶切。這保證了對緩沖液有特殊要求的酶也能良好工作。由于內(nèi)切酶在非最佳緩沖液中進行酶切反應(yīng)時，反應(yīng)速度會減緩，因此需要增加酶量或延長反應(yīng)時間。通過《內(nèi)切酶在不同緩沖液里的活性表》可查看第二種酶在特殊緩沖液相應(yīng)鹽濃度下的作用活性。

限制性內(nèi)切酶

限制性內(nèi)切酶能特異地結(jié)合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內(nèi)或其附近的特異位點上,并切割雙鏈DNA。它可分為三類:Ⅰ類和Ⅲ類酶在同一蛋白質(zhì)分子中兼有切割和修飾(甲基化)作用且依賴于ATP的存在。Ⅰ類酶結(jié)合于識別位點并隨機的切割識別位點不遠處的DNA，而Ⅲ類酶在識別位點上切割DNA分子,然后從底物上解離。Ⅱ類由兩種酶組成:一種為限制性內(nèi)切核酸酶(限制酶),它切割某一特異的核苷酸序列;另一種為獨立的甲基化酶,它修飾同一識別序列。Ⅱ類中的限制性內(nèi)切酶在分子克隆中得到了廣泛應(yīng)用，它們是重組DNA的基礎(chǔ)。絕大多數(shù)Ⅱ類限制酶識別長度為4至6個核苷酸的回文對稱特異核苷酸序列(如EcoRⅠ識別六個核苷酸序列:5'-G↓AATTC-3'),有少數(shù)酶識別更長的序列或簡并序列。Ⅱ類酶切割位點在識別序列中,有的在對稱軸處切割,產(chǎn)生平末端的DNA片段(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3');有的切割位點在對稱軸一側(cè),產(chǎn)生帶有單鏈突出末端的DNA片段稱粘性末端,如EcoRⅠ切割識別序列后產(chǎn)生兩個互補的粘性末端。

5'…G↓AATTC…3'→5'…GAATTC…3'

3'…CTTAA↑G…5'→3'…CTTAAG…5'

DNA純度、緩沖液、溫度條件及限制性內(nèi)切酶本身都會影響限制性內(nèi)切酶的活性。大部分限制性內(nèi)切酶不受RNA或單鏈DNA的影響。當微量的污染物進入限制性內(nèi)切酶貯存液中時,會影響其進一步使用,因此在吸取限制性內(nèi)切酶時,每次都要用新的吸管頭。如果采用兩種限制性內(nèi)切酶,必須要注意分別提供各自的最適鹽濃度。若兩者可用同一緩沖液,則可同時水解。若需要不同的鹽濃度,則低鹽濃度的限制性內(nèi)切酶必須首先使用,隨后調(diào)節(jié)鹽濃度,再用高鹽濃度的限制性內(nèi)切酶水解。也可在第一個酶切反應(yīng)完成后，用等體積酚/氯仿抽提，加0.1倍體積3mol/LNaAc和2倍體積無水乙醇，混勻后置-70℃低溫冰箱30分鐘，離心、干燥并重新溶于緩沖液后進行第二個酶切反應(yīng)。

酶切實驗

實驗?zāi)康模?/p>

1．掌握限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA的原理。

2．掌握重組質(zhì)粒DNA的酶切鑒定方法。

3．掌握瓊脂糖凝膠電泳分析酶切結(jié)果。

基本原理

限制性核酸內(nèi)切酶是一類能識別雙鏈DNA中特定堿基順序的核酸水解酶（水解磷酸二酯鍵）。根據(jù)酶的識別切割特性、催化條件及是否具有修飾酶活性，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大類。通常所指的DNA限制性核酸內(nèi)切酶就是Ⅱ型酶。

主要試劑

重組質(zhì)粒DNA插入片段300bp

本實驗所用限制性核酸內(nèi)切酶為EcoRⅠ，其識別順序為：

5′----G↓AATTC----3′

3′----CTTAA↑G----5′

磷酸二脂鍵斷裂產(chǎn)生5′粘性末端。

操作步驟

1.反應(yīng)體系的建立：

⑴在一無菌1.5mlEppendorf管中加入：?

無菌雙蒸水7μl?

10×酶切緩沖液2μl?

質(zhì)粒DNA(100ng/μl)10μl?

EcoRⅠ(5U/μl)1μl?

總體積為20μl

⑵輕輕混勻，12000rpm離心5sec。

2.37℃水浴1h。

3.將Eppendorf管置65℃水浴中10min，通過加熱使酶失活以終止反應(yīng)。

4.12000rpm離心5sec，將管蓋及管壁上的水離下。

酶切技術(shù)

5.取10μl消化產(chǎn)物，與2μl6×上樣緩沖液混勻，瓊脂糖凝膠電泳檢測消化效果，電泳條件：約100V30～60min。

6結(jié)果觀察。

操作注意事項：

1.吸樣量一定要準確

2.為了不使酶污染而導(dǎo)致浪費，最后才加酶

3.要求在冰上操作，并充分混勻，

4.開啟Eppendorf管時，手不要接觸到管蓋內(nèi)面，以防污染。

5.樣品在37℃與65℃保溫時，將離心管蓋嚴，以防水進入管內(nèi)造成實驗失敗

。

限制性內(nèi)切酶酶解中常見的問題和原因

1．DNA完全沒有被限制性內(nèi)切酶切割：①限制性內(nèi)切酶失活；②DNA不純，含有SDS、有機溶劑、EDTA等；③非限制性內(nèi)切酶最佳反應(yīng)條件；④酶切位點被修飾；⑤DNA上不存在該酶的識別順序。

2．DNA切割不完全：①限制性內(nèi)切酶活性下降或稀釋不正確；②DNA不純或反應(yīng)條件不佳；③酶切位點被修飾；④部分DNA溶液粘在管壁上；⑤酶切后DNA粘末端退火。

3．DNA片段數(shù)目多于理論值：①限制性內(nèi)切酶星號活力；②存在第二種限制性內(nèi)切酶污染；③樣品DNA中含有其它DNA。

技術(shù)問題

酶切技術(shù)

雙酶切時間及其體系：酶切過夜，其實完全沒有必要，一般酶切3個小時，其實1個小時已經(jīng)足夠。應(yīng)用大體系，如100微升。

純化問題：純化PCR產(chǎn)物割膠還是柱式，優(yōu)選柱式，因為割膠手法不準，很容易割下大塊的膠，影響純化效率?，F(xiàn)在的柱式純化號稱可以祛除引物，既然如此，酶切掉的幾個堿基肯定也會被純化掉了。所以，PCR產(chǎn)物和雙酶切產(chǎn)物的純化均可應(yīng)用柱式純化。優(yōu)選TAKARA的純化柱試劑盒。

酶量的問題：以TAKARA的為例，其對1單位酶的定義如下：在50μl反應(yīng)液中，30℃溫度下反應(yīng)1小時，將1μg的λDNA完全分解的酶量定義為1個活性單位(U)。而該酶濃度約為15單位/微升，在除外酶降解的因素外，該酶可分解15μg的DNA，而一般從1-4ml菌液提出的DNA約為3μg，而PCR純化后的產(chǎn)物（50體系）約為3μg，所以即便全部加進去，只要純化的質(zhì)量好，酶切完全切得動。

2、酶切、回收后的PCR產(chǎn)物與載體的連接

摩爾比的計算，回收的載體片段：回收的PCR產(chǎn)物片段=1：10　，一般取前者0.03pmol，后者取0.3pmol。

pmol為單位的DNA轉(zhuǎn)換為為μg單位的DNA：（Xpmoles×長度bp×650）/1,000,000（注：長度bp×650是該雙鏈DNA的分子量）所得數(shù)值即為μg,也可以直接用這個公式套.1pmol1000bpDNA=0.66μg,如載體是5380bp，則0.03pmol為0.03×5.38×0.66=0.106524μg。

測DNA濃度可以在專用機子上測，注意OD值，一般約1.8-2.0.另外，如果嫌麻煩，也可用MARKER進行估測，如MARKER2000，5微升的MARKER每個條帶約50ng。

連接反應(yīng)：TAKARA的連接酶上的說明寫的過夜，而其對連接酶單位的定義為：在20μl的連接反應(yīng)體系中，6μg的λDNA-HindIII的分解物在16℃下反應(yīng)30分鐘時，有90%以上的DNA片段被連接所需要的酶量定義為1個活性單位（U）。而它的濃度為350U/μl，所以完全夠用。連接酶容易失活，注意低溫操作。時間3個小時足已。

3、轉(zhuǎn)化：

a、全量（10μl）加入至100μlJM109感受態(tài)細胞中，冰中放置30分鐘。

b、42℃加熱45秒鐘后，再在冰中放置1分鐘。

c、加入890μlAMP陰性培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)60分鐘。

取100μl鋪板。也可離心后余100μl。