RT -PCR（用于檢測基因表達水平的反應）

簡介

RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉錄PCR，是將RNA的反轉錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增（PCR）相結合的技術。首先經反轉錄酶的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段。RT-PCR技術靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA，關鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。

用于反轉錄的引物可視實驗的具體情況選擇隨機引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結構的真核細胞mRNA，三種都可。

反轉錄酶選擇

1． Money 鼠白血病病毒（MMLV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性，RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。

2． 禽成髓細胞瘤病毒（AMV）反轉錄酶：有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。

3．Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩(wěn)定性反轉錄酶：在Mn存在下，允許高溫反轉錄RNA，以消除RNA模板的二級結構。

4．MMLV反轉錄酶的RNase H突變體：商品名為SuperScript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA，這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

合成引物選擇

1． 隨機六聚體引物：當特定mRNA由于含有使反轉錄酶終止的序列而難于拷貝其全長序列時，可采用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源于rRNA。

2． Oligo(dT)：是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3’端Poly(A)尾，此引物與其配對，僅mRNA可被轉錄。由于Poly(A)RNA僅占總RNA的1-4%，故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和復雜性方面均要小。

3． 特異性引物：最特異的引發(fā)方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物，若PCR反應用二種特異性引物，第一條鏈的合成可由與mRNA 3’端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA，導致更為特異的PCR擴增。

試劑準備

1．RNA提取試劑

2．第一鏈cDNA合成試劑盒

3．dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

4．Taq DNA聚合酶

影響因素

（一）組織或細胞樣本

不是每種組織或細胞都表達所有的基因，即某些基因的mRNA不存在于某些組織或細胞中。因此，確定所選用的材料中是否含有需擴增的目標mRNA模板是實驗成敗的關鍵。

（二）引物

合成cDNA第一條鏈時，引物可用隨機6聚核苷酸，或下游引物，或poly（dT），其中以6聚核苷酸的隨機引物效果最好。

（三）反轉錄酶

不同來源的反轉錄酶均可較好地用于第一鏈cDNA的合成，其合成受不同RNA模板的影響。提高反轉錄溫度（55℃）、增加1～3倍的酶量可克服RNA二級結構的影響。

（四）cDNA反應產物

合成eDNA第一鏈所用的RNA模板不影響PCR反應，無需用堿或RNase處理去除。另外，沒有必要將cDNA反應產物全部用于PCR，用其1/25～1/10即可。

（五）RNA酶污染

避免RNA酶污染是RT—PCR成功的關鍵之一。用于RNA操作的各種器皿，包括Eppen—dorf管、Tip頭等，都應該用RNA酶抑制劑處理，試劑應該用RNase—free水配制。使用的全部器皿和耐高壓的試劑都必須經高壓滅菌處理。在操作全過程中，操作者都應該戴一次性手套和口罩，以防污染

操作步驟

RT-PCR反應原理

2. cDNA第一鏈的合成：目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售，其原理基本相同，但操作步驟不一?，F以長沙贏潤生物技術有限公司提供的操作手冊為例：

（1）在0.5ml微量離心管中，加入總RNA 1-5μg，補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，輕輕混勻、離心。

（2）70℃加熱10min，立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列試劑的混合物：

10×PCR buffer 2μl

25mM MgCl2 2μl

10mM dNTPmix 1μl

0.1M DTT 2μl

輕輕混勻，離心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加熱15min以終止反應。

（5）將管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解殘留的RNA。-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列試劑：

第一鏈cDNA 2μl

上游引物（10pM） 2μl

下游引物（10pM） 2μl

dNTP(2mM) 4μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

（2）加入適量的ddH2O，使總體積達50μl。輕輕混勻，離心。

（3）設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環(huán)。為了保證實驗結果的可靠與準確，可在PCR擴增目的基因時，加入一對內參（如G3PD）的特異性引物，同時擴增內參DNA，作為對照。

（4）電泳鑒定：行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

（5）密度掃描、結果分析：采用凝膠圖像分析系統，對電泳條帶進行密度掃描。

注意事項

1． 在實驗過程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中，注意避免mRNA的斷裂。

2． 為了防止非特異性擴增，必須設陰性對照。

3． 內參的設定：主要為了用于靶RNA的定量。常用的內參有G3PD（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）、β-Actin（β-肌動蛋白）等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。

4． PCR不能進入平臺期，出現平臺效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對于每一個目標序列出現平臺效應的循環(huán)數，均應通過單獨實驗來確定。

5． 防止DNA的污染：

（1）采用DNA酶處理RNA樣品。

（2）在可能的情況下，將PCR引物置于基因的不同外顯子，以消除基因和mRNA的共線性。

三點注意事項合成cDNA的引物，避免RNA酶的污染，不同來源的逆轉錄酶。