簡(jiǎn)介

粘性放線菌19246胞壁表面有大量的傘狀物存在，其胞壁厚度約為26～29nm,和T14-V的電鏡研究結(jié)果一致，形態(tài)學(xué)研究表明粘性放線茵19246是有毒菌株。胞壁化學(xué)成分分析表明聚肽糖占主要成分，約為41%,其他為糖(24%)和蛋白質(zhì)(13.6%)。目前不少人認(rèn)為聚肽糖和傘狀物是粘性放線菌的毒力所在。[1]

相關(guān)資料

粘性放線菌(以下簡(jiǎn)稱粘放菌)與齲病(尤其是根面齲)以及牙周病的發(fā)生均有關(guān)[1,2]。其致病作用的首要條件是它對(duì)宿主的粘附和定居。眾多研究結(jié)果表明[3,4],粘放菌表面的菌毛與粘放菌的粘附有關(guān)。粘放菌有兩種功能及抗原性不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。隨著對(duì)粘放菌粘附機(jī)理的深入研究[5,6],認(rèn)為菌毛上存在與粘附有關(guān)的蛋白質(zhì)，即粘結(jié)素。目前，對(duì)粘放菌菌毛上粘結(jié)素的結(jié)構(gòu)與成分尚不清楚。為了深入研究?jī)煞N菌毛的生物性能，以及菌毛上的粘結(jié)素，提取粘放菌菌毛成為研究的起點(diǎn)。目前，國(guó)內(nèi)尚未見這方面的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在建立一套提取和鑒定粘放菌菌毛的法。[2]

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)研究所劉正教授惠贈(zèng)。抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體由美國(guó)Florida大學(xué)Nesbitt教授惠贈(zèng)。凝膠過濾柱Sepharose 6B由美國(guó)Sigma公司提供。

1.2細(xì)菌的培養(yǎng)和收集

選用胰蛋白胨大豆瓊脂(TSB)非選擇性厭氧菌培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)(80%N2,20%CO2),經(jīng)形態(tài)染色、生化鑒定及血清學(xué)鑒定符合標(biāo)準(zhǔn)后，納入實(shí)驗(yàn)菌株。根據(jù)兩種菌毛的生物學(xué)性能的差異，確定5519只有Ⅰ型菌毛,5951只有Ⅱ型菌毛。

將粘放菌5519、5951分別接種于TSB固體培養(yǎng)基上,37℃厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.0)洗下平板上的細(xì)菌，分別離心收集兩種細(xì)菌(3000 r/min,10分鐘),再加入0.01 mol/L PBS緩沖液。

1.3 菌毛的分離

參照機(jī)械攪動(dòng)法[7,8]分離菌毛與胞壁。在4℃冰箱內(nèi)，磁力攪拌器攪拌菌懸液5分鐘,4℃高速離心(12000×g,20分鐘),收集上清液。將細(xì)菌沉淀按上述過程再處理1次。合并2次離心的上清液，為菌毛粗提物。

1.4 菌毛的提純

用20%飽和硫酸銨沉淀上清液[4,9],4℃高速離心(16000×g,30分鐘),沉淀用少量0.01 mol/L PBS緩沖液溶解，并用相同的緩沖液反復(fù)透析2天，收集蛋白溶液，即為初步純化菌毛。貯存于-20℃冰箱內(nèi)備用。

預(yù)先用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.0)平衡Sepharose 6 B柱。將1.5 ml初步純化菌毛蛋白上樣，用同樣緩沖液洗脫(5 ml/h),收集樣品(2 ml/管)。紫外線分光光度計(jì)測(cè)定每管OD280 nm值，計(jì)算機(jī)繪制洗脫圖譜。合并電鏡觀察到含有菌毛的組分，即為部份純化菌毛。冷凍干燥。

將部份純化菌毛溶于1.0 ml緩沖液中，再次上樣，按上述方法經(jīng)Sepharose 6 B柱層析進(jìn)一步分離純化。

1.5 菌毛的鑒定

1.5.1 電鏡觀察 參照Clark等、劉正等[10,11]介紹的方法觀察菌毛在處理前后的細(xì)菌表面及不同階段提取物中存在與否。

1.5.2 免疫學(xué)鑒定 采用對(duì)流免疫電泳法鑒定?？乖瓰棰裥突颌蛐途拇痔嵛铩⒉糠菁兓图兓??？贵w為抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體。

2 結(jié) 果

2.1 菌毛的提取結(jié)果

粘放菌5519、5951培養(yǎng)48小時(shí)后，電鏡觀察可見菌體表面有長(zhǎng)短不一的菌毛(圖1)。機(jī)械攪動(dòng)2次后，菌體表面菌毛基本消失，菌體完整(圖2)。說明本實(shí)驗(yàn)采用的方法使菌毛與菌體間有最大程度的分離。