簡介

粘性放線菌19246胞壁表面有大量的傘狀物存在，其胞壁厚度約為26～29nm,和T14-V的電鏡研究結(jié)果一致，形態(tài)學研究表明粘性放線茵19246是有毒菌株。胞壁化學成分分析表明聚肽糖占主要成分，約為41%,其他為糖(24%)和蛋白質(zhì)(13.6%)。目前不少人認為聚肽糖和傘狀物是粘性放線菌的毒力所在。[1]

相關(guān)資料

粘性放線菌(以下簡稱粘放菌)與齲病(尤其是根面齲)以及牙周病的發(fā)生均有關(guān)[1,2]。其致病作用的首要條件是它對宿主的粘附和定居。眾多研究結(jié)果表明[3,4],粘放菌表面的菌毛與粘放菌的粘附有關(guān)。粘放菌有兩種功能及抗原性不同的菌毛:Ⅰ型菌毛和Ⅱ型菌毛。隨著對粘放菌粘附機理的深入研究[5,6],認為菌毛上存在與粘附有關(guān)的蛋白質(zhì)，即粘結(jié)素。目前，對粘放菌菌毛上粘結(jié)素的結(jié)構(gòu)與成分尚不清楚。為了深入研究兩種菌毛的生物性能，以及菌毛上的粘結(jié)素，提取粘放菌菌毛成為研究的起點。目前，國內(nèi)尚未見這方面的報道。本實驗旨在建立一套提取和鑒定粘放菌菌毛的法。[2]

1 材料和方法

1.1 實驗材料

粘放菌5519(1+2-)和5951(1-2+)由上海第二醫(yī)科大學口腔醫(yī)學研究所劉正教授惠贈。抗Ⅰ型菌毛和抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體由美國Florida大學Nesbitt教授惠贈。凝膠過濾柱Sepharose 6B由美國Sigma公司提供。

1.2細菌的培養(yǎng)和收集

選用胰蛋白胨大豆瓊脂(TSB)非選擇性厭氧菌培養(yǎng)基。37℃厭氧培養(yǎng)(80%N2,20%CO2),經(jīng)形態(tài)染色、生化鑒定及血清學鑒定符合標準后，納入實驗菌株。根據(jù)兩種菌毛的生物學性能的差異，確定5519只有Ⅰ型菌毛,5951只有Ⅱ型菌毛。

將粘放菌5519、5951分別接種于TSB固體培養(yǎng)基上,37℃厭氧培養(yǎng)48小時，用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.0)洗下平板上的細菌，分別離心收集兩種細菌(3000 r/min,10分鐘),再加入0.01 mol/L PBS緩沖液。

1.3 菌毛的分離

參照機械攪動法[7,8]分離菌毛與胞壁。在4℃冰箱內(nèi)，磁力攪拌器攪拌菌懸液5分鐘,4℃高速離心(12000×g,20分鐘),收集上清液。將細菌沉淀按上述過程再處理1次。合并2次離心的上清液，為菌毛粗提物。

1.4 菌毛的提純

用20%飽和硫酸銨沉淀上清液[4,9],4℃高速離心(16000×g,30分鐘),沉淀用少量0.01 mol/L PBS緩沖液溶解，并用相同的緩沖液反復透析2天，收集蛋白溶液，即為初步純化菌毛。貯存于-20℃冰箱內(nèi)備用。

預先用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH7.0)平衡Sepharose 6 B柱。將1.5 ml初步純化菌毛蛋白上樣，用同樣緩沖液洗脫(5 ml/h),收集樣品(2 ml/管)。紫外線分光光度計測定每管OD280 nm值，計算機繪制洗脫圖譜。合并電鏡觀察到含有菌毛的組分，即為部份純化菌毛。冷凍干燥。

將部份純化菌毛溶于1.0 ml緩沖液中，再次上樣，按上述方法經(jīng)Sepharose 6 B柱層析進一步分離純化。

1.5 菌毛的鑒定

1.5.1 電鏡觀察 參照Clark等、劉正等[10,11]介紹的方法觀察菌毛在處理前后的細菌表面及不同階段提取物中存在與否。

1.5.2 免疫學鑒定 采用對流免疫電泳法鑒定?？乖瓰棰裥突颌蛐途拇痔嵛铩⒉糠菁兓图兓？贵w為抗Ⅰ型菌毛或抗Ⅱ型菌毛的多克隆抗體。

2 結(jié) 果

2.1 菌毛的提取結(jié)果

粘放菌5519、5951培養(yǎng)48小時后，電鏡觀察可見菌體表面有長短不一的菌毛(圖1)。機械攪動2次后，菌體表面菌毛基本消失，菌體完整(圖2)。說明本實驗采用的方法使菌毛與菌體間有最大程度的分離。