cRNA探針是以cDNA為模板在體外轉(zhuǎn)錄而成的探針，可方便地通過已克隆于特定質(zhì)粒載體的DNA產(chǎn)生。這些質(zhì)粒通常在緊鄰多克隆位點的位置含有一個噬菌體啟動子。應(yīng)用相關(guān)的RNA聚合酶和4種核糖核苷(rNTPs)(其中至少一種帶有標(biāo)記物)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，依賴DNA的RNA聚合酶以克隆的cDNA為模板，以含有標(biāo)記物的三磷酸核糖核苷為原料，從啟動子下游開始在體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA。通過改變外源cDNA在質(zhì)粒中的插入方向或選用不同的RNA聚合酶，可以控制RNA的轉(zhuǎn)錄方向(即以cDNA的哪條鏈為模板轉(zhuǎn)錄RNA)，從而可以得到與mRNA同序列的同義RNA探針(senseprobe)或與mRNA互補的反義RNA探針(antlsense probe)，后者即互補RNA(cRNA)探針。通常用同義RNA探針作cRNA探針的陰性對照。

正文

實現(xiàn)原理

由于在體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)物中可提供有標(biāo)記物標(biāo)記的核苷酸為原料．因此經(jīng)過體外轉(zhuǎn)錄就能得到標(biāo)記的cRNA探針。cRNA探針是單鏈探針，故以cRNA探針進(jìn)行雜交反應(yīng)可避免應(yīng)用雙鏈cDNA探針作雜交反應(yīng)時存在的兩條鏈之間的復(fù)性問題。cRNA和mRNA之間形成的雜交體要比cDNA-mRNA雜交體穩(wěn)定。因此雜交反應(yīng)后可經(jīng)受高度嚴(yán)格洗滌。cRNA-mRNA雜交體不受RNA酶的影響，故雜交后還可用RNA酶處理，以除去未結(jié)合的探針。此外，體外轉(zhuǎn)錄合成的cRNA探針的長度比較一致。由于cRNA探針具有以上優(yōu)點，因此在分子雜交中，特別是在原位雜交中的應(yīng)用較廣泛。但cRNA探針的制備過程較復(fù)雜，需要較高的分子生物學(xué)實驗條件，cRNA對RNA酶敏感，易被RNA酶破壞，因而在操作過程中需嚴(yán)格防止RNA酶污染。