概括介紹

原位雜交早在1969年開始使用，并于1981年開始用于RNA 的原位雜交檢測[1, 2] 。

RNA原位雜交方法有：

傳統(tǒng)RNA 原位雜交

Isotopic ISH

使用放射性標(biāo)記的RNA探針進(jìn)行的。Isoptopic ISH 可以達(dá)到高敏感性，但是需要很長的曝光時間（數(shù)天到數(shù)周），同時只提供有限的形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)。該種雜交方法由于使用的探針很長，曝光時間也很長，所以存在非特異性雜交以及長時間曝光導(dǎo)致與高背景干擾信號產(chǎn)生。由于以上問題以及放射性污染，從而限制了此項(xiàng)技術(shù)的普遍應(yīng)用。

非-ISOTOPIC ISH

熒光標(biāo)記或者生物素寡核苷酸探針的應(yīng)用極大程度地促進(jìn)了RNA原位雜交的應(yīng)用，該方法縮短了實(shí)驗(yàn)時間，同時達(dá)到了放射性探針的雜交敏感性。這類探針可以在雜交后通過熒光或者可見光酶促反應(yīng)成像。作為一種DNA探針的替代物，RNA探針使用ribo探針，該探針可以通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生，通常有幾百個堿基。與DNA寡核苷酸探針相比，ribo探針可以和目標(biāo)RNA形成更加穩(wěn)定的雜交，從而允許使用高強(qiáng)度的洗脫條件來增加非特異性。但是，由于RNA的天然特性，使得該類探針的標(biāo)記物位點(diǎn)有限，由于存在非特異性結(jié)合導(dǎo)致較高的非特異性雜交，導(dǎo)致DNA 寡核苷酸探針與RNA riboprobes 探針的信噪比無法有效控制。另外，在檢測靈敏度上也有一定局限。對于低水平表達(dá)或者部分降解的RNA，不能做到很好的檢測。

直接法RNA 原位雜交

直接檢測RNA 原位雜交方法，例如目前市場上Biosearch 公司（Stellaris ? , Biosearch TechnologiesPetaluma, CA）使用直接熒光標(biāo)記的小的單鏈寡核苷酸探針。多個探針設(shè)計(jì)針對每個目標(biāo)RNA，每個與一小段序列互補(bǔ)，它們結(jié)合延伸至整個序列的長度。以這種方式，使用多個探針可以確保提高靈敏度，并且在不可避免的一個或兩個探針非特異性雜交背景下熒光信號足以觀測到。由于直接檢測標(biāo)記的探針，這項(xiàng)技術(shù)是簡單而快速的。然而，該技術(shù)的靈敏度和信噪比仍然很局限，需要專門的去背景算法進(jìn)行結(jié)果分析。

新一代RNA原位雜交

RNAscope? 原位雜交

RNAscope?專利技術(shù)是近年來最火的RNA原位雜交技術(shù)，是RNA原位雜交（ISH）領(lǐng)域的一項(xiàng)重大進(jìn)步。由Advanced Cell Diagnostics公司（Newark, CA）開發(fā)，通過專利的雙“Z”探針設(shè)計(jì)和信號放大系統(tǒng)，使RNA原位雜交具有高度特異性、單分子檢測的敏感性并有極高的信噪比，能夠在單細(xì)胞水平同時定量多個RNA的表達(dá)，在獲得單細(xì)胞中單拷貝RNA表達(dá)數(shù)據(jù)的同時提供完整的組織形態(tài)學(xué)信息。

RNAscope 方法克服了以前的RNA原位雜交技術(shù)的非特異性雜交、靈敏度低、對樣本要求高等弱點(diǎn)，可替代傳統(tǒng)的ISH/FISH RNA 原位檢測，同時單分子檢測靈敏度提供了在組織細(xì)胞原位對單個細(xì)胞中基因的表達(dá)進(jìn)行檢測，釋放RNA作為生物標(biāo)記的全部潛能，提高對疾病與標(biāo)志物之間復(fù)雜的生物學(xué)相關(guān)性的認(rèn)識，是理想的能夠用于NGS和芯片技術(shù)后期轉(zhuǎn)化研究技術(shù)平臺。

RNAscope? 原位雜交步驟：

RNAscope?原位雜交是一項(xiàng)新穎的用于檢測位于組織細(xì)胞原位的目標(biāo)RNA的原位雜交（In Situ Hybridization，ISH)檢測技術(shù)。該技術(shù)進(jìn)行RNA原位雜交檢測主要分成5步。

Step 1：

透化：通過RNAscope?預(yù)處理試劑盒處理載玻片上固定好的組織或細(xì)胞，暴露目標(biāo)RNA。

Step 2：

探針雜交：針對靶基因設(shè)計(jì)RNAscope?專利Z型探針與目標(biāo)RNA雜交。

Step 3：

信號放大：RNAscope?檢測試劑盒逐級信號放大。

Step 4：

信號可視化：在普通光學(xué)顯微鏡或者多光譜熒光成像系統(tǒng)下，每一個目標(biāo)RNA分子以一個點(diǎn)狀信號的形式呈現(xiàn)。

Step 5：

量化分析：顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或者使用圖像分析軟件如RNAscope? SpotStudio? 或HALO對每一個細(xì)胞中的RNA單分子信號進(jìn)行精確定量分析。