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腺苷酸環(huán)化酶（將ATP轉(zhuǎn)變成cAMP的酶）

次瀏覽 | 更新時間：2023-05-22

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腺苷酸環(huán)化酶

將ATP轉(zhuǎn)變成cAMP的酶

腺苷酸環(huán)化酶，簡稱AC，是膜整合蛋白，能夠?qū)TP轉(zhuǎn)變成cAMP，引起細(xì)胞的信號應(yīng)答，是G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)中的效應(yīng)物。腺苷酸環(huán)化酶廣泛分布于哺乳動物的細(xì)胞膜中。

基本信息

中文名	腺苷酸環(huán)化酶
外文名	adenylate cyclase
簡稱	AC
分布	細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上
類型	膜整合蛋白
作用	將ATP轉(zhuǎn)變成cAMP

收起

體系

多肽、蛋白質(zhì)類及兒茶酚胺激素如腎上腺素、胰高血糖素、胰島素、促腎上腺皮質(zhì)素、促甲狀腺素等都是通過這一信息傳遞而發(fā)揮作用的。腺苷酸環(huán)化酶廣泛分布于哺乳動物的細(xì)胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并釋放焦磷酸。

激素和相應(yīng)的膜受體結(jié)合后，經(jīng)G蛋白的中介激活腺苷酸環(huán)化酶。激素受體嵌在細(xì)胞膜的脂雙層內(nèi)，它與激素結(jié)合的部位面向細(xì)胞外側(cè)。腺苷酸環(huán)化酶也居質(zhì)膜中，位于細(xì)胞內(nèi)側(cè)。

G蛋白位于細(xì)胞質(zhì)膜胞漿面的一種外周蛋白，由3個亞基Gα、Gβ及Gγ，由于α亞基結(jié)構(gòu)和作用不同，可分為激動型G蛋白和抑制型G蛋白兩類。

激動型 G蛋白（Gs）未被激活前，Gα蛋白與GDP結(jié)合，呈無活性狀態(tài)，一旦受體與激素結(jié)合后，即可誘發(fā)G蛋白上的Gα-GDP 與GTP交換，成為活性狀態(tài)的Gα-GTP 。同時，Gα-GTP即與Gβγ部分分離，并移動到鄰近的βγ腺苷酸環(huán)化酶部位，以激活腺苷酸環(huán)化酶，后者催化ATP變成cAMP。但Gα-GTP的壽命是短暫的，因為Gα本身具有GTP酶的活性，可以水解GTP為GDP與Pi。又成無活性的Gα-GDP，并返回與Gβγ結(jié)合成完整的無活性的G蛋白（a-βγ）-GDP。

另有一類G蛋白抑制型G蛋白（Gi），會抑制I,V,和VI亞型的AC的活性例如胰島素、生長素抑制素通過Gi使細(xì)胞內(nèi)cAMP濃度下降。但Gi對II和IV型則有正向刺激作用。

另外，Ca離子跟鈣調(diào)蛋白（calmodulin）也可以激活A(yù)CI型與III和VIII型。

實驗方法

腺苷酸環(huán)化酶的電鏡酶細(xì)胞化學(xué)試驗方法

腺苷酸環(huán)化酶主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－環(huán)磷酸腺苷（cAMP）并釋放出焦磷酸。

Howell等人（1972）首先用亞胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地對動物細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶進行了定位?，F(xiàn)已確認(rèn)，在未固定和固定的組織中，ATP－PNP是腺苷酸環(huán)化酶的專一性底物，在腺苷酸環(huán)化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者與捕捉鉛離子反應(yīng)，生成一種不溶性的電子密度很高的產(chǎn)物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點， Fujiomto等（1981）設(shè)計了使用二鉀亞砜（DMSO）的硝酸鉛法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸鉛法。

固定：配制固定液的緩沖液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩沖液，內(nèi)含8%蔗糖、5%的DMSO。

固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對于肝臟來說，1%以上的戊二醛固定時，可導(dǎo)致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存?？傮w來說，多聚甲醛與戊二醛的濃度應(yīng)因組織而異。一般在0～4℃固定2小時或室溫固定1小時。

洗滌：用配制固定液相同的緩沖液漂洗1小時～過夜，期間更換緩沖液數(shù)次；而后進行厚切片；

孵育：配方及條件見 ef{table:Enzyme-7}.

作為腺苷酸環(huán)化酶特異底物的AMP－PNP在室溫中或長期冷凍保存時，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，應(yīng)引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP－PNP 容易受到組織的堿性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在堿性磷酸酶活性高的組織內(nèi)，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，應(yīng)根據(jù)組織不同進行前處理后，將氟化鈉加入到孵育液中。

后固定：后固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩沖液進行充分洗滌。

殘存的DMSO可以與鋨酸反應(yīng)，產(chǎn)生擴散性的微細(xì)顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩沖液配制的1%～2%的鋨酸。鋨酸后固定時對酶反應(yīng)產(chǎn)物有一定的影響，有人認(rèn)為固定時間不應(yīng)超過10min，超過后可引起酶反應(yīng)產(chǎn)物顆粒變粗變大、擴散，有時由于全部溶出而導(dǎo)致完全沒有反應(yīng)產(chǎn)物的陰性結(jié)果。因此認(rèn)為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內(nèi)。也有用2～4%的戊二醛代替鋨酸進行后固定。

對照實驗中可除去底物AMP－PNP，也可在對照實驗的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

DMSO的硝酸鉛法孵育液配方及條件table:Enzyme-7

孵育液配方：& Tris－順丁烯二酸緩沖液（pH 7.4） 80mM

蔗糖 8%

氟化 20mM

茶堿 2.0mM

AMP－PNP 0.5mM

硫酸鎂 4.0mM

左旋咪唑 2.5mM

DMSO 5%（V/V）

硝酸鉛 2.0mM

孵育條件：孵育液pH 7.4

孵育溫度 37℃

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