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DNA復(fù)制
DNA雙鏈進行的復(fù)制過程
基本信息
| 中文名 | DNA復(fù)制 |
| 拉丁學(xué)名 | replication |
| 外文名 | DNA replication |
| 途徑 | 半保留復(fù)制 |
| 簡寫 | DNA |
| 作用 | 生物遺傳的基礎(chǔ) |
| 載體 | 所有DNA為遺傳物質(zhì)的生物體 |
| 過程 | 引發(fā)、延伸、終止 |
收起
定義
DNA復(fù)制
DNA復(fù)制主要包括引發(fā)、延伸、終止三個階段。
簡介
DNA復(fù)制是生物遺傳的基礎(chǔ)，是所有生物體中最基本的過程。而這一過程是半保留復(fù)制，是以最開始的雙鏈分子中的一條作為模板進行DNA復(fù)制，產(chǎn)生兩個完全一致的DNA分子。細胞水平的校正和糾錯機制能確保非常精確地復(fù)制DNA的拷貝。DNA復(fù)制發(fā)生在基因組的特定位置也就是起始點，DNA分子在起始點形成復(fù)制叉開始復(fù)制。
DNA復(fù)制從起始序列開始單向或雙向進行。合成DNA雙螺旋的兩條鏈是反向平行排列的，其中一條鏈的起始端與另一條鏈的末尾端平行排列在一起，每一個復(fù)制叉只有一條鏈是按照從尾到頭的正確方向指導(dǎo)新鏈從頭到尾方向合成。根據(jù)這條指導(dǎo)鏈，DNA復(fù)制持續(xù)向前合成復(fù)制叉。
DNA復(fù)制不能沿滯后鏈進行，也就是說，從頭到尾的DNA鏈，直到已經(jīng)復(fù)制了足夠長度的DNA分子，否則DNA復(fù)制不會繼續(xù)沿著模本鏈進行復(fù)制，DNA復(fù)制于是從新合成復(fù)制叉處分開。在復(fù)制過程中必須暫停并等待更多的親本DNA鏈片段，而此時整個長度只是沿著開始到結(jié)束方向前進了一小段距離。
復(fù)制體
復(fù)制體是一個執(zhí)行DNA復(fù)制的復(fù)雜分子機器。它由大量的次級元件組成，每一個次級元件在復(fù)制的過程中都行使一個特殊的功能。解螺旋酶能切斷兩條DNA分子之間的氫鍵，從而在DNA合成前分開兩條鏈。當解螺旋酶解開雙螺旋時，引導(dǎo)DNA其它區(qū)域的超螺旋體排列好。
旋轉(zhuǎn)酶的作用是解開由解旋酶切斷DNA鏈產(chǎn)生的超螺旋化，解旋酶使DNA鏈旋轉(zhuǎn)并釋放超螺旋體，使它們重新加入到DNA鏈中。旋轉(zhuǎn)酶最常見于復(fù)制叉的上游，形成超螺旋的位置。
DNA合成酶Ⅲ由2個催化核心構(gòu)成，一個引導(dǎo)DNA鏈復(fù)制，一個間隔DNA鏈。但是DNA合成酶Ⅲ不能停留足夠時間，有效地復(fù)制姐妹鏈。于是包含3個亞基的二聚物β聚合物共同包裹住DNA鏈使DNA合成酶Ⅲ留在DNA鏈上，確保DNA聚合酶Ⅲ能在鏈上合成幾千個核酸而不是幾百個。
DNA合成酶Ⅰ將引物酶添加的RNA引物去掉，完成岡崎片段。而DNA合成酶Ⅰ的作用會使岡崎片段之間產(chǎn)生小的空白區(qū)域，這就需要連接酶將岡崎片段連接起來，最終兩個岡崎片段的末端以共價鍵結(jié)合。
單鏈結(jié)合蛋白綁定在暴露的堿基上竭力防止DNA鏈的不穩(wěn)定并保證單鏈DNA之間不會由氫鍵形成危險的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。DNA合成酶包含一個校對機制，通常指的是“外切核酸酶活性”，即將錯誤添加的核酸去除掉。
起源
DNA的復(fù)制是對那些堅持達爾文主義世界觀的的人們的一項基本挑戰(zhàn)。作為生物信息被復(fù)制并傳遞給后代的過程，這是一個對于細胞的自我復(fù)制過程必要的機制。細胞的自我復(fù)制對于任何選擇性的過程中都是必要的，比如自然選擇。因此，試圖用自然選擇來解釋這個機制巨大的復(fù)雜性需要人們先要假設(shè)他們想解釋的東西的客觀存在。由于其極為復(fù)雜的性質(zhì)，大多數(shù)生化學(xué)者先前認為該系統(tǒng)產(chǎn)生，是在最后一個共同祖先的起源之前。此外，許多生化學(xué)家長久以來一直把在所有生命中觀察到的DNA復(fù)制的功能性的相似當作DNA復(fù)制的單一的起源。不過在1999年，美國國家衛(wèi)生研究院的研究人員證明，參與細菌和古細菌或真核細胞（生命進化之樹的兩個主干）的DNA復(fù)制的核心酶其實并沒有一個共同的進化起源。因此，它看起來好像細菌和古細菌獨自產(chǎn)生了兩個相同的DNA復(fù)制系統(tǒng) — 在這兩個進化的譜系據(jù)信分化自最后的共同祖先之后。
復(fù)制引發(fā)
復(fù)制的引發(fā)（Priming)階段包括DNA復(fù)制起點雙鏈被DNA解旋酶解開，通過轉(zhuǎn)錄激活步驟合成RNA分子；RNA引物的
DNA復(fù)制
為什么需要有RNA引物來引發(fā)DNA復(fù)制呢？這可能盡量減少DNA復(fù)制起始處的突變有關(guān)。DNA復(fù)制開始處的幾個核苷酸最容易出現(xiàn)差錯，因此，用RNA引物即使出現(xiàn)差錯最后也要被DNA聚合酶Ⅰ切除，提高了DNA復(fù)制的準確性。RNA引物形成后，由DNA聚合酶Ⅲ催化將第一個脫氧核苷酸按堿基互補原則加在RNA引物3'-OH端而進入DNA鏈的延伸階段。
過程
DNA雙螺旋的解旋
DNA在復(fù)制的時候，在DNA解旋酶的作用下，雙鏈首先解開，形成了復(fù)制叉，而復(fù)制叉的形成則是由多種蛋白質(zhì)和酶參與的較復(fù)雜的復(fù)制過程
（1）單鏈DNA結(jié)合蛋白（single—stranded DNA binding protein,ssbDNA蛋白）
ssbDNA蛋白是較牢固結(jié)合在單鏈DNA上的蛋白質(zhì)。原核生物ssbDNA蛋白和DNA結(jié)合時表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：如果第一個ssbDNA蛋白結(jié)合到DNA上去能力為1，第二個的結(jié)合能力可高達103；真核生物細胞里的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結(jié)合時則不表現(xiàn)上述效應(yīng)。ssbDNA蛋白作用是保證解旋酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，等待單鏈復(fù)制后才脫下來，重新循環(huán)。因此，ssbDNA蛋白僅保持單鏈的存在，是不起解旋作用。
（2）DNA解鏈酶（DNA helicase）
DNA解鏈酶可以通過水解ATP獲得能量以解開雙鏈DNA。這一種解鏈酶分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。若雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶能首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈的方向移動。復(fù)制時，大部分DNA解旋酶沿滯后模板的5’—〉3’方向并隨著復(fù)制叉的前進而移動，只有個別解旋酶（Rep蛋白）是沿著3’—〉5’方向移動。因而推測Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈DNA。
（3）DNA解鏈過程
DNA在復(fù)制前不僅為雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在為解鏈前的必須結(jié)構(gòu)狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外有一些特定蛋白質(zhì)，比如大腸桿菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部雙鏈被解開，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開單鏈，保證此局部不會恢復(fù)為雙鏈。兩條單鏈DNA復(fù)制的引發(fā)過程是有所差異，可是不論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈，都需要一段RNA引物用于開始子鏈DNA合成。因此前導(dǎo)鏈和后隨鏈的差別在于前者從復(fù)制起始點開始按5’—3’持續(xù)的合成下去、不形成岡崎片段、后者則隨著復(fù)制叉的出現(xiàn)、不斷合成長約2—3kb的岡崎片段。
岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制
因為DNA的兩條鏈是反向平行的，所以在復(fù)制叉附近解開的DNA鏈，一條為5’—〉3’方向，另一條為3’—〉5’方向，兩個模板極性是不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均為5’—〉3’方向，不為3’—〉5’方向，所以無法解釋DNA的兩條鏈同時進行復(fù)制的問題。解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速復(fù)制現(xiàn)象，日本的學(xué)者岡崎（Okazaki）等人提出了DNA的半不連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）模型。在1968年，岡崎用3H脫氧胸苷短時間標記大腸桿菌，提取DNA，變性之后用超離心方法得到了許多3H標記的，被后人稱作為岡崎片段的DNA。延長標記時間之后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓腄NA鏈，所以這些片段必然是復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物。另一個實驗也證明DNA復(fù)制過程里首先合成較小的片段，即用DNA連接酶溫度敏感突變株進行的試驗，在連接酶不起作用的溫度中，便產(chǎn)生大量小DNA片段積累，表明DNA復(fù)制過程里至少有一條鏈首先合成較短的片段，之后再由連接酶鏈成大分子DNA。一般說，原核生物的岡崎片段比真核生物長。深入研究還可證明，前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制與滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。
端粒和端粒酶
在1941年，美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出端粒（telomere)的假說，指出染色體末端必然存在一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。已知染色體端粒的作用至少有2：a.保護染色體末端免受損傷，使染色體保持穩(wěn)定；b. 與核纖層相連，使染色體得以定位。
弄清楚DNA復(fù)制過程之后，在20世紀70年代，科學(xué)家對DNA復(fù)制時新鏈5’端的RNA引物被切除之后，空缺為如何被填補的提出了質(zhì)疑。如果不填補豈不是DNA每復(fù)制一次就短一點。后隨鏈復(fù)制為例，RNA引物被切除后，岡崎片段之間是由DNA聚合酶I催化合成的DNA填補之，然后再由DNA連接酶將它們連接成了一條完整的鏈。可是DNA聚合酶I催化合成DNA時，需要自由3’—OH作為其引物，最后余下子鏈的5’則無法填補，于是染色體就短一點。
在正常體細胞里普遍存在著染色體酶復(fù)制一次端粒就短一次的現(xiàn)象。推測，可能一旦端?？s短至某一閾限長度一下時，就會發(fā)出一個警報，指令細胞進入到衰老；或許為當細胞判斷出它們的染色體已變得太短了，所以是分裂也就停止了，造成了正常體細胞壽命有一定界限?？墒窃?/span>癌細胞中染色體端粒卻一直維持在一定長度上，這是為什么，這是因為DNA復(fù)制之后，將染色體末端短缺部分補上需要端粒酶，是一種含有RNA的酶，其既解決了模板，又解決引物的問題。在生殖細胞與85%癌細胞中都測出了端粒酶具有活性，可是在正常體細胞中卻無活性，20世紀90年代中期Blackburn首次在原生動物中克隆出端粒酶基因。
端粒酶在癌細胞里具有活性，不僅使癌細胞可以不斷分裂增生，且為癌變前的細胞或已經(jīng)是癌性的細胞提供了時間，積累附加的突變，即等于增加了它們復(fù)制，侵入與最終轉(zhuǎn)移的能力。同時人們也由此萌生開發(fā)以端粒為靶的藥物，即通過抑制癌細胞里端粒酶活性而達到治療癌癥的目的。
至于真核細胞DNA末端結(jié)構(gòu)特點，早就在1978年，Blackburn就以原生動物四膜出（一種纖毛蟲）為例說明之：a.迥紋形式的發(fā)夾環(huán)；b.僅由C,A組成的簡單序列大量重復(fù)（C4A2）20~70；c.鏈上有許多缺口（nicks）
復(fù)制條件
酶和蛋白質(zhì) | 作用 |
幫助解開復(fù)制叉前后的超螺旋結(jié)構(gòu) | |
DNA解旋酶 | 解開螺旋 |
Rep蛋白 | 幫助解開雙螺旋結(jié)構(gòu) |
引物合成酶 | 催化RNA引物合成并與DNA鏈互補的反應(yīng) |
單鏈結(jié)合蛋白 | 穩(wěn)定單連區(qū) |
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鏈的延伸
DNA新生鏈的合成由DNA聚合酶Ⅲ所催化，然而，DNA必須由螺旋酶在復(fù)制叉處邊移動邊解開雙鏈。這樣就產(chǎn)生了一種拓撲學(xué)上的問題：由于DNA的解鏈，在DNA雙鏈區(qū)勢必產(chǎn)生正超螺旋，在環(huán)狀DNA中更為明顯，當達到一定程度后就會造成復(fù)制叉難再繼續(xù)前進，從而終
DNA復(fù)制
在DNA復(fù)制叉處要能由兩套DNA聚合酶Ⅲ在同一時間分別進行復(fù)制DNA前導(dǎo)鏈和滯后鏈。如果滯后鏈模板環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ，然后再折向與未解鏈的雙鏈DNA在同一方向上，則滯后鏈的合成可以和前導(dǎo)鏈的合成在同一方向上進行。
這樣，當DNA聚合酶Ⅲ沿著滯后鏈模板移動時，由特異的引物酶催化合成的RNA引物即可以由DNA聚合酶Ⅲ所延伸。當合成的DNA鏈到達前一次合成的岡崎片段的位置時，滯后鏈模板及剛合成的岡崎片斷便從DNA聚合酶Ⅲ上釋放出來。這時，由于復(fù)制叉繼續(xù)向前運動，便產(chǎn)生了又一段單鏈的滯后鏈模板，它重新環(huán)繞DNA聚合酶Ⅲ全酶，并通過DNA聚合酶Ⅲ開始合成新的滯后鏈岡崎片段。通過這樣的機制，前導(dǎo)鏈的合成不會超過滯后鏈太多（最后只有一個岡崎片段的長度）。而且，這樣引發(fā)體在DNA鏈上和DNA聚合酶Ⅲ以同一速度移動。
多種DNA聚合酶在DNA復(fù)制過程中扮演不同的角色。在大腸桿菌中，DNA Pol III是主要負責DNA復(fù)制的聚合酶。它在復(fù)制分支上組裝成復(fù)制復(fù)合體，具有極高的持續(xù)性，在整個復(fù)制周期中保持完整。相反，DNA Pol I是負責用DNA替換RNA引物的酶。 DNA Pol I除了具有聚合酶活性外，還具有5'至3'外切核酸酶活性，并利用其外切核酸酶活性降解RNA引物。 Pol I在DNA復(fù)制中的主要功能是創(chuàng)建許多短DNA片段，而不是產(chǎn)生非常長的片段。在真核生物中，Pol α有助于啟動復(fù)制，因為它與引物酶形成復(fù)合物。Pol ε和Pol δ負責前導(dǎo)鏈的合成。Pol δ還負責引物的去除，而Pol ε也參與復(fù)制期間DNA的修復(fù)
按上述DNA復(fù)制的機制，在復(fù)制叉附近，形成了以兩套DNA聚合酶Ⅲ全酶分子、引發(fā)體和螺旋構(gòu)成的類似核糖體大小的復(fù)合體，稱為DNA復(fù)制體(replisome)。復(fù)制體在DNA前導(dǎo)鏈模板和滯后鏈模板上移動時便合成了連續(xù)的DNA前導(dǎo)鏈和由許多岡崎片段組成的滯后鏈。在DNA合成延伸過程中主要是DNA聚合酶Ⅲ的作用。當岡崎片段形成后，DNA聚合酶Ⅰ通過其5'→3'外切酶活性切除岡崎片段上的RNA引物，同時，利用后一個岡崎片段作為引物由5'→3'合成DNA。最后兩個岡崎片段由DNA連接酶將其接起來，形成完整的DNA滯后鏈。
終止
DNA復(fù)制
才終止其DNA復(fù)制。但最近的實驗表明，在DNA上也存在著復(fù)制終止位點，DNA復(fù)制將在復(fù)制終止位點處終止，并不一定等全部DNA合成完畢。但對復(fù)制終止位點的結(jié)構(gòu)和功能了解甚少。在DNA復(fù)制終止階段令人困惑的一個問題是，線性DNA分子兩端是如何完成其復(fù)制的？已知DNA復(fù)制都要有RNA引物參與。當RNA引物被切除后，中間所遺留的間隙由DNA聚合Ⅰ所填充。但是，在線性分子的兩端以5'→3'為模板的滯后鏈的合成，其末端的RNA引物被切除后是無法被DNA聚合酶所填充的。
在研究T7DNA復(fù)制時，這個問題部分地得到了解決。T7DNA兩端的DNA序列區(qū)有160bp長的序列完全相同。而且，在T7DNA復(fù)制時，產(chǎn)生的子代DNA分子不是一個單位T7DNA長度，而是許多單位長度的T7DNA首尾連接在一起。T7DNA兩個子代DNA分子都會有一個3'端單鏈尾巴，兩個子代DNA的3'端尾巴以互補結(jié)合形成兩個單位T7DNA的線性連接。然后由DNA聚合酶Ⅰ填充和DNA連接酶連接后，繼續(xù)復(fù)制便形成四個單位長度的T7DNA分子。這樣復(fù)制下去，便可形成多個單位長度的T7DNA分子。這樣的T7DNA分子可以被特異的內(nèi)切酶切開，用DNA聚合酶填充與親代DNA完全一樣的雙鏈T7DNA分子。
DNA復(fù)制
真核生物在染色體的多個點開始DNA復(fù)制，因此復(fù)制叉在染色體的許多點處相遇并終止。由于真核生物具有線性染色體，DNA復(fù)制無法到達染色體的最末端。由于這個問題，在染色體末端的DNA在每個復(fù)制周期中都會丟失。端粒是接近末端的重復(fù)DNA區(qū)域，有助于防止基因丟失。端粒縮短是體細胞中的正常過程，它縮短了子DNA染色體的端粒。因此，在DNA丟失阻止進一步分裂之前，細胞只能分裂一定次數(shù)。在生殖細胞中，端粒酶延伸端粒區(qū)域的重復(fù)序列以防止降解。
DNA復(fù)制的終止發(fā)生在特定的基因位點，即復(fù)制終止位點。該位點的終止位點序列被與該序列結(jié)合的阻止DNA復(fù)制的蛋白質(zhì)識別并結(jié)合，阻止了復(fù)制叉前進，復(fù)制終止。細菌物的DNA復(fù)制末端位點結(jié)合蛋白又稱Ter蛋白。
因為細菌具有環(huán)狀染色體，所以當兩個復(fù)制叉在親本染色體的另一端彼此相遇時復(fù)制終止發(fā)生。大腸桿菌通過使用終止序列來調(diào)節(jié)該過程，當該序列被Tus蛋白結(jié)合時，終止序列僅允許復(fù)制叉一個方向的通行。結(jié)果，復(fù)制叉總是在染色體的終止區(qū)域內(nèi)相遇，導(dǎo)致復(fù)制終止
在環(huán)狀DNA的復(fù)制的末端終止階段則不存在上述問題。環(huán)狀DNA復(fù)制到最后，由DNA拓撲異構(gòu)酶Ⅱ切開雙鏈DNA，將兩個DNA分子分開成為兩個完整的與親代DNA分子一樣的子代DNA。
DNA復(fù)制的特點
1．半保留復(fù)制：DNA在復(fù)制時，以親代DNA的每一股作模板，合成完全相同的兩個雙鏈子代DNA，每個子代DNA中都含有一股親代DNA鏈，這種現(xiàn)象稱為DNA的半保留復(fù)制。DNA以半保留方式進行復(fù)制，是在1958年由M. Meselson 和 F. Stahl 所完成的實驗所證明。
2．有一定的復(fù)制起始點：DNA在復(fù)制時，需在特定的位點起始，這是一些具有特定核苷酸排列順序的片段，即復(fù)制起始點（復(fù)制子）。在原核生物中，復(fù)制起始點通常為一個，而在真核生物中則為多個。
3．需要引物（primer)：DNA聚合酶必須以一段具有3'端自由羥基（3'-OH）的RNA作為引物，才能開始聚合子代DNA鏈。RNA引物的大小，在原核生物中通常為50～100個核苷酸，而在真核生物中約為10個核苷酸。
5．半不連續(xù)復(fù)制：由于DNA聚合酶只能以5'→3'方向聚合子代DNA鏈，因此兩條親代DNA鏈作為模板聚合子代DNA鏈時的方式是不同的。以3'→5'方向的親代DNA鏈作模板的子代鏈在聚合時基本上是連續(xù)進行的，這一條鏈被稱為領(lǐng)頭鏈（leading strand)。而以5'→3'方向的親代DNA鏈為模板的子代鏈在聚合時則是不連續(xù)的，這條鏈被稱為隨從鏈（lagging strand)。DNA在復(fù)制時，由隨從鏈所形成的一些子代DNA短鏈稱為岡崎片段（Okazaki fragment)。岡崎片段的大小，在原核生物中約為1000～2000個核苷酸，而在真核生物中約為100個核苷酸。
相關(guān)說明
DNA的復(fù)制是一個邊解旋邊復(fù)制的過程。復(fù)制開始時，DNA分子首先利用細胞提供的能量，在解旋酶的作用下，把兩條螺旋的雙鏈解開，這個過程叫解旋。然后，以解開的每一段母鏈為模板，以周圍環(huán)境中的四種脫氧核苷酸為原料，按照堿基配對互補配對原則，在DNA聚合酶的作用下，各自合成與母鏈互補的一段子鏈。隨著解旋過程的進行，新合成的子鏈也不斷地延伸，同時，每條子鏈與其母鏈盤繞成雙螺旋結(jié)構(gòu)，從而各形成一個新的DNA分子。這樣，復(fù)制結(jié)束后，一個DNA分子，通過細胞分裂分配到兩個子細胞中去！
注：復(fù)制時遵循堿基互補配對原則，復(fù)制發(fā)生在細胞分裂的間期。
DNA是遺傳信息的載體，故親代DNA必須以自身分子為模板準確的復(fù)制成兩個拷貝，并分配到兩個子細胞中去，完成其遺傳信息載體的使命。而DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)對于維持這類遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定性和復(fù)制的準確性都是極為重要的。
（一）DNA的半保留復(fù)制
Waston和Click在提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型時曾就DNA復(fù)制過程進行過研究，他們推測，DNA在復(fù)制過程中堿基間的氫鍵首先斷裂，雙螺旋解旋分開，每條鏈分別作模板合成新鏈，每個子代DNA的一條鏈來自親代，另一條則是新合成的，故稱之為半保留式復(fù)制（semiconservative replication)。
（二）DNA復(fù)制的起始，方向和速度
DNA在復(fù)制時，雙鏈DNA解旋成兩股分別進行。其復(fù)制過程的復(fù)制起點呈現(xiàn)叉子的形式，故稱復(fù)制叉。以復(fù)制叉向前移動的方向為標準，一條模板鏈為3’—〉5’走向，在其上DNA能以5’—〉3’方向連續(xù)合成，稱為前導(dǎo)鏈（leading strand)；另一條模板鏈為5’—〉3’走向，在其上DNA也是5’—〉3’方向合成，但與復(fù)制叉移動的方向正好相反，故隨著復(fù)制叉的移動形成許多不連續(xù)的岡崎片段，最后在連成一條完整的DNA鏈，該鏈稱為后隨鏈（lagging strand)。實驗證明DNA的復(fù)制是由一個固定的起始點開始的。一般把生物體的單個復(fù)制單位稱為復(fù)制子。一個復(fù)制子只含一個復(fù)制起點。一般說，細菌，病毒即線粒體DNA分子均作為單個復(fù)制子完成其復(fù)制，真核生物基因組可以同時在多個復(fù)制起點上進行雙向復(fù)制，即它們的基因組包括多個復(fù)制子。多方面的實驗結(jié)果表明，大多數(shù)生物內(nèi)DNA的復(fù)制都是從固定的起始點以雙向等速方式進行的。復(fù)制叉以DNA分子上某一特定順序為起始點，向兩個方向等速生長前進。圖8-3-6 DNA復(fù)制過程
DNA復(fù)制過程
（三）DNA復(fù)制過程
以原核生物DNA復(fù)制過程予以簡要說明
1．DNA雙螺旋的解旋
DNA在復(fù)制時，其雙鏈首先解開，形成復(fù)制叉，而復(fù)制叉的形成則是由多種蛋白質(zhì)及酶參與的較復(fù)雜的復(fù)制過程
ssbDNA蛋白是較牢固的結(jié)合在單鏈DNA上的蛋白質(zhì)。原核生物ssbDNA蛋白與DNA結(jié)合時表現(xiàn)出協(xié)同效應(yīng)：若第1個ssbDNA蛋白結(jié)合到DNA上去能力為1，第2個的結(jié)合能力可高達103；真核生物細胞中的ssbDNA蛋白與單鏈DNA結(jié)合時則不表現(xiàn)上述效應(yīng)。ssbDNA蛋白的作用是保證解旋酶解開的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體的形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才脫下來，重新循環(huán)。所以，ssbDNA蛋白只保持單鏈的存在，不起解旋作用。（2）DNA解鏈酶（DNA helicase） DNA解鏈酶能通過水解ATP獲得能量以解開雙鏈DNA。這種解鏈酶分解ATP的活性依賴于單鏈DNA的存在。如果雙鏈DNA中有單鏈末端或切口，則DNA解鏈酶可以首先結(jié)合在這一部分，然后逐步向雙鏈方向移動。復(fù)制時，大部分DNA解旋酶可沿滯后模板的5’—〉3’方向并隨著復(fù)制叉的前進而移動，只有個別解旋酶（Rep蛋白）是沿著3’—〉5’方向移動的。故推測Rep蛋白和特定DNA解鏈酶是分別在DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用以解開雙鏈DNA。（3）DNA解鏈過程 DNA在復(fù)制前不僅是雙螺旋而且處于超螺旋狀態(tài)，而超螺旋狀態(tài)的存在是解鏈前的必須結(jié)構(gòu)狀態(tài)，參與解鏈的除解鏈酶外還有一些特定蛋白質(zhì)，如大腸桿菌中的Dna蛋白等。一旦DNA局部雙鏈解開，就必須有ssbDNA蛋白以穩(wěn)定解開的單鏈，保證此局部不會恢復(fù)成雙鏈。兩條單鏈DNA復(fù)制的引發(fā)過程有所差異，但是不論是前導(dǎo)鏈還是后隨鏈，都需要一段RNA引物用于開始子鏈DNA的合成。因此前導(dǎo)鏈與后隨鏈的差別在于前者從復(fù)制起始點開始按5’—3’持續(xù)的合成下去，不形成岡崎片段，后者則隨著復(fù)制叉的出現(xiàn)，不斷合成長約2—3kb的岡崎片段。
2．岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制
因DNA的兩條鏈是反向平行的，故在復(fù)制叉附近解開的DNA鏈，一條是5’—〉3’方向，另一條是3’—〉5’方向，兩個模板極性不同。所有已知DNA聚合酶合成方向均是5’—〉3’方向，不是3’—〉5’方向，因而無法解釋DNA的兩條鏈同時進行復(fù)制的問題。為解釋DNA兩條鏈各自模板合成子鏈等速復(fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者岡崎（Okazaki）等人提出了DNA的半連續(xù)復(fù)制（semidiscontinuous replication）模型。1968年岡崎用3H脫氧胸苷短時間標記大腸桿菌，提取DNA，變性后用超離心方法得到了許多3H標記的，被后人稱作岡崎片段的DNA。延長標記時間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒霥NA鏈，因此這些片段必然是復(fù)制過程中的中間產(chǎn)物。另一個實驗也證明DNA復(fù)制過程中首先合成較小的片段，即用DNA連接酶溫度敏感突變株進行試驗，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小DNA片段積累，表明DNA復(fù)制過程中至少有一條鏈首先合成較短的片段，然后再由連接酶鏈成大分子DNA。一般說，原核生物的岡崎片段比真核生物的長。深入研究還證明，前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界具有普遍性，故稱為DNA雙螺旋的半不連續(xù)復(fù)制。
3．復(fù)制的引發(fā)和終止
所有的DNA的復(fù)制都是從一個固定的起始點開始的，而DNA聚合酶只能延長已存在的DNA鏈，不能從頭合成DNA鏈，新DNA的復(fù)制是如何形成的？經(jīng)大量實驗研究證明，DNA復(fù)制時，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，再由聚合酶從RNA引物3’端開始合成新的DNA鏈。對于前導(dǎo)鏈來說，這一引發(fā)過程比較簡單，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此為起點，一直合成下去。對于后隨鏈，引發(fā)過程較為復(fù)雜，需要多種蛋白質(zhì)和酶參與。后隨鏈的引發(fā)過程由引發(fā)體來完成。引發(fā)體由6種蛋白質(zhì)構(gòu)成，預(yù)引體或引體前體把這6種蛋白質(zhì)結(jié)合在一起并和引發(fā)酶或引物過程酶進一步組裝形成引發(fā)體。引發(fā)體似火車頭一樣在后隨鏈分叉的方向前進，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)的引發(fā)生成滯后鏈的引物RNA短鏈，再由DNA聚合酶 III 作用合成DNA，直至遇到下一個引物或?qū)槠螢橹埂Ｓ蒖NA酶H降解RNA引物并由DNA聚合酶 I 將缺口補齊，再由DNA連接酶將每兩個岡崎片段連在一起形成大分子DNA.。
（四）端粒和端粒酶
1941年美籍印度人麥克林托克（Mc Clintock）就提出了端粒（telomere)的假說，認為染色體末端必然存在一種特殊結(jié)構(gòu)——端粒。已知染色體端粒的作用至少有二：① 保護染色體末端免受損傷，使染色體保持穩(wěn)定；② 與核纖層相連，使染色體得以定位。
在弄清楚DNA復(fù)制過程之后，20世紀70年代科學(xué)家對DNA復(fù)制時新鏈5’端的RNA引物被切除后，空缺是如何被填補的提出了質(zhì)疑。如不填補豈不是DNA每復(fù)制一次就短一點。以后隨鏈復(fù)制為例，當RNA引物被切除后，岡崎片段之間是由DNA聚合酶 I催化合成的DNA填補之，然后再由DNA連接酶將它們連接成一條完整的鏈。但是DNA聚合酶 I 催化合成DNA時，需要自由3’—OH作為引物，最后余下子鏈的5’無法填補，于是染色體就短了一點。
在正常體細胞中普遍存在著染色體酶復(fù)制一次端粒就短一次的現(xiàn)象。人們推測，可能一旦端粒縮短到某一閾限長度一下時，他們就會發(fā)出一個警報，指令細胞進入衰老；或許是當細胞判斷出它們的染色體已變得太短了，于是分裂也就停止了，造成正常體細胞壽命有一定界限。但是在癌細胞中染色體端粒卻一直維持在一定長度上，這是為什么？這是因為DNA復(fù)制后，把染色體末端短缺部分補上需要端粒酶，這是一種含有RNA的酶，它既解決了模板，又解決了引物的問題。在生殖細胞和85%癌細胞中都測出了端粒酶具有活性，但是在正常體細胞中卻無活性，20世紀90年代中期，Blackburn首次在原生動物中克隆出端粒酶基因。
端粒酶在癌細胞中具有活性，它不僅使癌細胞可以不斷分裂增生，而且它為癌變前的細胞或已經(jīng)是癌性的細胞提供了時間，以積累附加的突變，即等于增加它們復(fù)制，侵入和最終轉(zhuǎn)移的能力。同時人們也由此萌生了開發(fā)以端粒為靶的藥物，即通過抑制癌細胞中端粒酶活性而達到治療癌癥的目的。
至于真核細胞DNA末端的結(jié)構(gòu)特點，早就在1978年Blackburn就以原生動物四膜蟲（一種纖毛蟲）為例說明之：① 迥紋形式的發(fā)夾環(huán)；② 僅由C,A組成的簡單序列大量重復(fù)（C4A2）20~70；③ 鏈上有許多缺口（nicks）。
參考資料
[1]
DNA Replication · allaboutscience[引用日期2013-04-02]
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