“吸光光度分析方法”又稱(chēng)“紫外及可見(jiàn)分光光度法(Ultraviolet-visible Spectrophotometry, UV-Vis)”,是根據(jù)物質(zhì)分子對(duì)紫外及可見(jiàn)光譜區(qū)的吸收特性和吸收程度,對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析的一種吸收光譜法。

定律簡(jiǎn)介

全自動(dòng)生化分析儀檢驗(yàn)血液中各物質(zhì)含量的分析是吸光光度分析方法的應(yīng)用之一,根據(jù)分析化學(xué)中的顯色反應(yīng),利用不同的生化試劑把不同物質(zhì)的含量通過(guò)顏色深淺反應(yīng)出來(lái),再由郎伯-比爾定律定量分析其濃度。

原理介紹

布格(Bouguer)和郎伯(Lambert)先后在1729年和1760年闡明輻射強(qiáng)度和吸收層厚度的關(guān)系,1852年比爾(Beer)又提出輻射強(qiáng)度和吸收物濃度也具有類(lèi)似的關(guān)系,這便是著名的布格-郎伯-比爾定律。比爾定律的數(shù)學(xué)表達(dá)式為:

A= = bc (2-1)

式中,A為吸光度,I0為入射輻射強(qiáng)度,It為透過(guò)輻射強(qiáng)度,b為吸收層厚度(cm),C為吸收物的摩爾濃度(M),ε為摩爾吸光系數(shù)(L﹒mol﹒cm)。此定律廣泛應(yīng)用于紫外-可見(jiàn)-紅外光譜區(qū)吸收測(cè)量,全自動(dòng)生化分析儀中各項(xiàng)生化指標(biāo)的檢驗(yàn)也依據(jù)于此定律。

比爾定律的成立是以下列條件為前提的:

入射輻射為單色輻射;吸收過(guò)程中各物質(zhì)無(wú)相互作用,但各物質(zhì)的吸光度具有加合性;輻射與物質(zhì)的作用僅限于吸收過(guò)程,沒(méi)有熒光、散射和光化學(xué)現(xiàn)象;吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系。

如偏離以上任意一點(diǎn),吸光度與濃度(或吸收層厚度)的線性關(guān)系將受影響,從而影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確度。其中(2)、(3)由生化分析試劑的特性來(lái)保證,(1)由光學(xué)系統(tǒng)來(lái)保證,(4)由攪拌機(jī)構(gòu)來(lái)保證。

誤差來(lái)源

熒光和光化學(xué)反應(yīng)的影響

通常的生化試劑的熒光效率很低,產(chǎn)生的熒光又是各向同性的,只有非常少的一部分沿透射方向進(jìn)入檢測(cè)器,所以熒光的影響是可以忽略的。

采用后分光技術(shù)時(shí),即復(fù)色光先照射比色池再進(jìn)入單色器,由于樣品所受的光輻射比較強(qiáng),有可能發(fā)生光化學(xué)反應(yīng),因此,一方面要盡量減弱入射光的強(qiáng)度,另一方面要選擇不容易發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)的檢驗(yàn)試劑。

反射和散射效應(yīng)的影響

比爾定律成立的前提條件是吸收物是一種均勻分布的連續(xù)體系,如果待測(cè)液體有渾濁質(zhì)點(diǎn),當(dāng)光輻射通過(guò)時(shí)會(huì)產(chǎn)生散射效應(yīng),它對(duì)吸光光度分析方法測(cè)量的影響表現(xiàn)為光程不確定,散射光的一部分和透射光一起進(jìn)入檢測(cè)器,導(dǎo)致比爾定律的偏離。然而,渾濁的試樣在臨床生化檢驗(yàn)中是極為常見(jiàn)的,甚至一些檢驗(yàn)項(xiàng)目本身就是以測(cè)量試樣濁度為基礎(chǔ)的,為了減小散射效應(yīng)的影響,可采取雙波長(zhǎng)或三波長(zhǎng)分光光度法。

光的非單色性帶來(lái)的誤差

比爾定律的重要假設(shè)條件之一是入射光為單色光,但是,即使是現(xiàn)代高精度分光光度計(jì),也不可能獲得純單色光。分光光度計(jì)單色光的純度主要取決于色散元件和光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)。大多數(shù)分光光度計(jì)只能獲得近似于單色的狹窄通光帶,它仍然具有復(fù)色光的性質(zhì),而復(fù)色光可導(dǎo)致比爾定律的正或負(fù)向偏離。

儀器的組成

光源(電源)系統(tǒng):光輻射與I的4次方成正比

恒溫系統(tǒng):37

單色器:濾光片、光譜儀

比色池:流動(dòng)、分立

探測(cè)器:光電池、光電倍增管

放大器:高輸入阻抗、低噪聲、電流-電壓變換

數(shù)據(jù)采集:A/D精度要求,3ABS=1/1000;3ABS-2.999ABS=18位A/D;1ABS-0.999ABS=12位A/D

分析軟件:醫(yī)學(xué)相關(guān)