短裸甲藻毒素（短裸甲藻毒素）

簡介

短裸甲藻屬于裸甲藻目（Gymnodiniales），裸甲藻科（Gymnodiniaceae），裸甲藻屬（Gymnodinium）。短裸甲藻毒素（Brevetoxin，BTX）主要是由雙鞭甲藻（Karenia bravisbrevis）產(chǎn)生的一類赤潮藻毒素，其他藻類如劇毒岡比甲藻（Gambierdiscums toxincus）、褐胞藻（Chattonella）、卡盾氏藻（Chattonella antiqua）、海洋褐胞藻（Chattonella marina）、針胞藻（Fibrocapsa japonica）和赤潮異彎藻（Heterosigma akashiwo）等也可產(chǎn)生BTX。

此類毒素可富集到貝類等生物體中，并導(dǎo)致消費者產(chǎn)生諸如惡心、嘔吐、腹瀉、痙攣、支氣管收縮、麻痹、昏迷等神經(jīng)性中毒癥狀，因此也曾被廣泛稱為神經(jīng)性貝毒（Neurotoxic Shellfish Poisoning，NSP）。不過，由于其他毒素如麻痹性貝毒（Paralytic Shellfish Poisoning，PSP）也可以導(dǎo)致消費者出現(xiàn)神經(jīng)性中毒癥狀，所以原有的分類方法已不能滿足管理和科研的需求。因此，2004年由聯(lián)合國糧農(nóng)組織、世界衛(wèi)生組織和政府間海洋委員會共同組建的雙殼軟體生物毒素工作組，根據(jù)毒素的基本結(jié)構(gòu)和化學(xué)性質(zhì)對現(xiàn)有貝類毒素進行了重新分類，從而將原有的神經(jīng)性貝毒命名為短裸甲藻毒素組毒素（Brevetoxin-group，BTX），簡稱為BTX毒素。產(chǎn)生該毒素的貝類主要分布在美洲墨西哥灣沿岸及新西蘭豪拉基海灣等海域。

物化特性

從化學(xué)性質(zhì)上來看，BTX屬于聚醚類的脂溶性藻類毒素（Lipophilic Phycotoxins，LPs），具熱穩(wěn)定性，易溶解于甲醇、乙醚等非極性有機試劑，該特性導(dǎo)致這類毒素在貝類等生物體中的消除半衰期長達數(shù)十天甚至數(shù)月。

短裸甲藻毒素及其衍生物分子結(jié)構(gòu)

墨西哥灣貝類中的BTX代謝產(chǎn)物最初是通過對東方牡蠣（Crassostreavirginica）組織提取物和水華水體進行分離發(fā)現(xiàn)的。隨后的研究表明純毒素，游離的PbTx-2主要在東方牡蠣中代謝，而游離的PbTx-3則主要以其原有的形態(tài)蓄積于牡蠣中。鑒定的東方牡蠣中PbTx-2的主要代謝產(chǎn)物包括還原產(chǎn)物PbTx-3，半胱氨酸硫氧化物結(jié)合物BTX-B2（之前在新西蘭貝類中發(fā)現(xiàn)的）和S-脫氧-BTX-B2。S-脫氧-BTX-B2可以穩(wěn)定的氧化成BTX-B2，用作貝類的檢測和定量鑒定。

就穩(wěn)定性與構(gòu)型關(guān)系而言，A型毒素較B型穩(wěn)定。在干燥狀態(tài)下或在有機溶劑內(nèi)，A型毒素的結(jié)構(gòu)仍完整不變。該毒素具耐熱性，在300℃時仍保持穩(wěn)定。pH值變化對穩(wěn)定性影響大。當(dāng)pH< 2或>10時可加速><型毒素的分解。在0.1mol/L NaOH水溶液中，毒素可用A環(huán)內(nèi)醋的皂化而滅活。經(jīng)臭氧分解，或在氯水（aqueous chloride）中亦使毒素活性受影響。

在東方牡蠣中，BTX代謝物的消除率和與其相關(guān)的極性和疏水性不是一致的。PbTx-1和PbTx-2的半胱氨酸結(jié)合物屬于極性最強的BTX代謝物，而同時也是持續(xù)最久的。Plakas等假設(shè)認(rèn)為PbTx-1和PbTx-2與半胱氨酸蛋白的二分之一相結(jié)合，從而使半胱氨酸-BTX通過蛋白水解作用內(nèi)收而緩慢釋放。游離的半胱氨酸或包含肽段的半胱氨酸（如谷胱甘肽）也可與PbTx-1和PbTx-2結(jié)合。貝類組織中半胱氨酸結(jié)合物最初快速消除的狀態(tài)表示此類結(jié)合物可能形成于游離的半胱氨酸或谷胱甘肽結(jié)合物的分解作用。

BTX毒素三維分子靜電勢圖

短裸甲藻毒素分子軌道模擬分布圖

將優(yōu)化得到的7個化合物的空間結(jié)構(gòu)疊加在一起，發(fā)現(xiàn)它們末端4個環(huán)可以很好地重合，從倒數(shù)第五個環(huán)開始，分子骨架出現(xiàn)彎曲，A型分子彎曲較小，近似直線型，而B型分子向上彎曲較大，這是由于B型H環(huán)構(gòu)象發(fā)生了不同程度的變化?？梢姺肿庸羌軓澢潭韧髯缘纳锘钚詮娙跏呛芎脤?yīng)的。因為A型比B型活性高，因此A型構(gòu)象更適宜同受體結(jié)合。

BTX毒素空間結(jié)構(gòu)對比模擬示意圖

毒性

BTX-2（B型）是渦鞭毛藻產(chǎn)生最多的BTX毒素。當(dāng)然，其他一些藻類，如古卡盾氏藻、海洋卡盾藻、針胞藻、赤潮異彎藻等也曾被報道可產(chǎn)生似BTX的生物毒素。BTX-2在貝類等生物體內(nèi)的代謝產(chǎn)物主要是BTX-3、BTX-B1、BTX-B2、S-desoxy-BTX-B2、BTX-B3、BTX-B4和BTX-B5。因此消費者食用受污染的貝類和魚類導(dǎo)致的中毒主要是由BTX毒素的代謝產(chǎn)物引起的，而非BTX毒素直接作用的結(jié)果。

BTX主要蓄積在東方牡蠣（Crassostreavirginica）、文蛤（Mercenaria）、峨螺（Busycon contrarium）、海扇（Austrovenus stutchburyi）、綠殼貽貝（Pernacanaliculus）等貝類中。貝類可通過攝食短裸甲藻細(xì)胞或從水中直接吸收BTX，并使其快速蓄積。牡蠣中的短裸甲藻水平較好地反映了短裸甲藻水華的進展和強度。已證實BTX可在接觸了純的BTX和短裸甲藻培養(yǎng)物的貝類中快速蓄積。在捕食雙殼貝類的食肉峨螺中發(fā)現(xiàn)，貝類中的營養(yǎng)轉(zhuǎn)移也是間接的。

BTX可在一些貝類體內(nèi)進行代謝。BTX代謝的第一例報道是1992～1993年在新西蘭爆發(fā)的NSP。幾年以后，美國發(fā)現(xiàn)的大范圍的BTX代謝證實是由接觸了短裸甲藻水華的貝類產(chǎn)生的，此次水華發(fā)生于墨西哥灣。其后發(fā)現(xiàn)BTX的代謝在多種貝類中都具有特征性。因為在短裸甲藻中B型BTX分布廣泛，所以最初從貝類中分離和鑒定出的BTX代謝物是B型BTX。

BTX-2和BTX-3的小鼠急性毒性試驗24 h半致死劑量分別為200mg/kg b.w.和170 mg/kg b.w.。小鼠腹腔注射BTX-B3 在劑量濃度在300mg/kg b. w.時不具有毒性，而BTX-B4和BTX-B5的最小致死劑量分別為100和300-500mg/kg b. w.。小鼠分別腹腔注射BTX-B2、BTX-3和S-desoxy-BTX-B2所產(chǎn)生的中毒癥狀基本相似。致死劑量毒素導(dǎo)致的癥狀主要包括：15min后不動，死亡前呼吸麻痹，眼球突出，快速彈動后腿；而亞致死劑量毒素則造成腹式呼吸速率先迅速上升后急劇下降，四肢完全癱瘓，但3-5h后運動能力恢復(fù)。在接下來的7d觀察期結(jié)束時未出現(xiàn)進一步病理異常。通過靜脈注射給藥，小鼠立即中毒死亡。

小鼠口服的半致死劑量只有BTX-2（6600 mg/kg b. w.）和BTX-3（520 mg/kg b. w.）的。口服給藥一般5h后才出現(xiàn)死亡，這與注射給藥可致急性死亡不同?？诜拘孕ЯTX-2比BTX-3要低一個數(shù)量級以上。毒性效力差異主要是吸收率的不同引起的，而不是因為BTX-2在經(jīng)過肝臟時進行了第一次代謝。

人類接觸短裸甲藻毒素有三個途徑：在赤潮期間，沿海形成之氣霧中雜有此種毒素，人類通過呼吸道吸入后導(dǎo)致哮喘樣發(fā)作，類似毒覃堿受體興奮之癥狀；赤潮毒化海洋環(huán)境污染了海洋魚貝類，人類因攝食污染短裸甲藻毒素的海鮮品而導(dǎo)致“神經(jīng)性貝中毒”。其中毒表現(xiàn)類似CTX中毒，主要有消化系統(tǒng)及神經(jīng)系統(tǒng)癥狀；皮膚接觸含短裸甲藻毒素的海水，導(dǎo)致皮膚及粘膜出現(xiàn)刺癢及水疤等表現(xiàn)。盡管尚無中毒死亡的報道，但此毒素的嚴(yán)重致病性已被臨床及病理學(xué)家所證實。由于此種毒素可導(dǎo)致呼吸衰竭或心室纖顫，故對人類的潛在致死性不容忽視。

發(fā)生NSP中毒的各地區(qū)對致毒貝類和魚類體內(nèi)BTX毒素的含量數(shù)據(jù)中，以1MU相當(dāng)于4μg，BTX-2計（貝類中污染的BTX毒素含量多以MUs/100g為單位），致毒貝類中BTX毒素的濃度從880至49000μgBTX-2/kg b.w.不等。Naar 等應(yīng)用競爭性ELISA 法測定魚肉中的BTX毒素（以BTX-3為標(biāo)準(zhǔn)），濃度從580至6000μgBTX-3/kg b.w.。歐洲國家尚無關(guān)于BTX類毒素在貝類和魚類中的限量標(biāo)準(zhǔn)。美國規(guī)定小鼠生物法安全標(biāo)準(zhǔn)為20 MUs/100g（0. 8 mgBTX-2/kg b. w.）。新西蘭和澳大利亞最高限量為20MUs/100g，未規(guī)定哪一類BTX類。

毒理

一般來說，主要采用腹腔注射、靜脈注射、口服等方式研究BTX毒素在小鼠體內(nèi)的毒代動力學(xué)。有報道的僅限于BTX-2和BTX-3。結(jié)果表明，小鼠腹腔注射BTX-2和BTX-3，1h后血水平達到最高值，BTX-2組比BTX-3組先達到正常血水平的3倍，BTX-2在24h后主要以共軛半胱氨酸結(jié)合物的形式從尿液排出; 而采用靜脈注射BTX-3，毒素在1 min內(nèi)在血液循環(huán)中消失，24h后通過膽汁排泄進入糞便; 若采用口服的方式，BTX-3快速且廣泛分散到各個器官，其中肝臟內(nèi)含量最高，最后主要伴隨尿液和糞便排出到體外，且兩種方式含量相差不大。

呼吸是BTX毒素引起神經(jīng)性中毒的主要方式之一，因此通過向小鼠氣管內(nèi)滴入3H標(biāo)記的BTX-3，研究該種方式引起的毒代動力學(xué)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氣管內(nèi)80%毒素被迅速吸收，從肺進入血液并被所有組織器官吸收。大部分的BTX-3從肺、肝臟和腎臟代謝迅速排出體外，另外20%的毒素分散到其他器官保留了7d。小鼠組脂肪、心臟、腸、腎臟、肝臟和肌肉的消除半衰期為28h，而大腦和睪丸大概需要90h。大約90%的毒素在96 h內(nèi)排出體外，其中11%從尿液、64%從糞便排出。

BTX毒素主要對呼吸和心肌功能有抑制作用，產(chǎn)生自發(fā)、反復(fù)的劑量依賴性肌肉收縮，造成束顫，抽搐或跳躍，與劑量顯著相關(guān)的呼吸速率下降，中樞和外周神經(jīng)的支氣管收縮。

若干研究結(jié)果表明，BTX毒素可致染色體體外斷裂。BTX-2可誘導(dǎo)中國倉鼠卵巢細(xì)胞染色體畸變。通過單細(xì)胞凝膠電泳發(fā)現(xiàn)用BTX-2、BTX-3和BTX-9 孵育人體淋巴細(xì)胞后DNA受損傷（鏈斷裂）。在BTX-2、BTX-3和BTX-6孵育人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞Jurkat E6-1后也發(fā)現(xiàn)了DNA損傷。Leighfield等報告說，通過吸入暴露，BTX-2誘導(dǎo)了大鼠肝細(xì)胞DNA損傷，表明BTX-2也可引發(fā)體內(nèi)染色體斷裂。

BTX是較強的鈉通道激活毒素，可以與鈉通道受體靶部位VI結(jié)合，開啟興奮膜上的鈉通道，可以使細(xì)胞膜對鈉離子的通透性增強，活化電壓門控鈉通道，產(chǎn)生較強的細(xì)胞去極化作用，引起神經(jīng)肌肉興奮的傳導(dǎo)發(fā)生改變，對鉀通道不起作用。因而，BTX具有胚胎毒性、發(fā)育毒性、免疫毒性、遺傳毒性和致癌作用等毒性效應(yīng)。

BTX毒素電泳圖

檢測方法

BTX毒素的分析法主要有小鼠生物法（Mousebioassay，MBA）、細(xì)胞毒性實驗（Cytotoxicity assays）、受體結(jié)合試驗（Receptor binding assays）、放射免疫法（Radioimmunoassay，RIA）、酶聯(lián)免疫法（ELISA）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）。其中，小鼠生物法是發(fā)展最早、應(yīng)用最廣泛的分析方法，而高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法則是定性、定量和靈敏度最好的方法。

BTX毒素所用的小鼠生物法是由美國公共衛(wèi)生協(xié)會建立（APHA，1970）。標(biāo)準(zhǔn)方法使用乙醚從貝類中提取毒素，以MUs/100g貝肉為單位。1MU被定義為對體重為20g的小鼠腹腔注射粗提毒素使50%的小鼠在930min內(nèi)死亡的用量，相當(dāng)于4μgBTX-2。然而，一些研究指出乙醚并不能有效地提取BTX毒素（例如半胱氨酸結(jié)合物）。而且MBA方法的特異性、重現(xiàn)性和靈敏度都很差，不僅耗時太長，而且容易受到其他內(nèi)源性化合物的影響，從而造成假陽性結(jié)果。

對貝類中的BTX毒素現(xiàn)已應(yīng)用多個端點和多種檢測方式進行毒性實驗。細(xì)胞毒性試驗是基于BTX對鈉離子運輸通道的作用。多采用神經(jīng)母細(xì)胞瘤，用藜蘆堿通過打開鈉離子運輸通道從而促進鈉離子的轉(zhuǎn)運，同時用哇巴因（Na+/K+- ATP 酶抑制劑）阻斷鈉鉀離子泵活性。BTX毒素結(jié)合藜蘆堿打開的鈉離子通道增加了離子流量。該細(xì)胞的生存力可以通過代謝溴化噻唑藍(lán)四氮唑成紫色結(jié)晶物質(zhì)的量測定，方法對貝類中BTX-1的最低檢出限0.25mg/kg。但Dickey等人指出細(xì)胞毒性試驗在實驗室之間的重現(xiàn)性差，應(yīng)用受到限制。

受體結(jié)合法是基于BTX毒素與鈉鹽傳輸通道受體的結(jié)合力差異。通常用于測定魚類和貝類中毒素含量的受體結(jié)合實驗，原理是放射性3H-BTX-3與天然BTX毒素與受體結(jié)合位點的競爭機制。從興奮性組織分離膜制備或通過全細(xì)胞制備用于試驗。半胱氨酸結(jié)合物（BTX-B2和S-desoxy-BTX-B2）與鈉離子通道受體的結(jié)合能力比BTX-3弱3-10倍。受體結(jié)合法的定量限是30μgBTX-3/kg牡蠣勻漿。

高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）方法已被廣泛地用于貝類、魚類和藻類BTX毒素的定性和定量分析。Dickey等對實驗室間LC-MS/MS 法檢測數(shù)據(jù)的差異性進行了研究。實際上，所有LC-MS/MS方法可以很容易的檢測出BTX-3加標(biāo)樣品，其含量水平比美國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)檢出限20MUs/100g或0.8 mgBTX-2/kg貝肉低出一個數(shù)量級。