考馬斯亮藍(lán)（coomassie brilliant blue）一定范圍內(nèi)與蛋白質(zhì)濃度成正比，因此可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。

中文名

考馬斯亮藍(lán)

外文名

coomassie brilliant blue

分類

G-250和R-250

作用

蛋白質(zhì)的定量測(cè)定

化學(xué)性質(zhì)

Coomassie brilliant blue G-250

分子結(jié)構(gòu)如右圖。

考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。

考馬斯亮藍(lán)G-250在游離狀態(tài)下呈紅色，最大光吸收在465nm；當(dāng)它與蛋白質(zhì)結(jié)合后變?yōu)榍嗌?，蛋白質(zhì)-色素結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質(zhì)含量成正比，經(jīng)595nm 測(cè)定，可作出蛋白質(zhì)含量與吸光度值的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度。R-250呈藍(lán)色，有輕微紅色。

染色

蛋白質(zhì)與考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合在2min左右的時(shí)間內(nèi)達(dá)到平衡，完成反應(yīng)十分迅速；其結(jié)合物在室溫下1h內(nèi)保持穩(wěn)定。該法是1976年Bradford建立，試劑配制簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便快捷，反應(yīng)非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測(cè)定微克級(jí)蛋白質(zhì)含量，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度范圍為0～1 000μg/mL，是一種常用的微量蛋白質(zhì)快速測(cè)定方法。

考馬斯亮藍(lán)有G-250和R-250兩種。其中考馬斯亮藍(lán)G-250由于與蛋白質(zhì)的結(jié)合反應(yīng)十分迅速，常用來作為蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。考馬斯亮藍(lán)R-250與蛋白質(zhì)反應(yīng)雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對(duì)電泳條帶染色。

測(cè)定含量

簡(jiǎn)介

該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測(cè)定結(jié)果，如TritonX-100、SDS、NP-40等。常用于細(xì)胞骨架的檢驗(yàn)。

濃染液

將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85%的磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至1000mL，此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。

樣本準(zhǔn)備

盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20μg—150μg/100μL之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

溶解

將待測(cè)樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。

稀釋

按1：5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過濾除去。

作用

每個(gè)樣本加5mL

稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過30min．

計(jì)算

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。

觸及處理方法

考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無礙。