正文
技術原理
從生物樣本，如組織、血液、痰液中提取核酸（DNA、RNA），制備相應的模板、引物，進行多重PCR，然后采用凝膠電泳、PAGE電泳、HPLC、DHPLC、毛細管電泳等方法中的一種進行DNA片段分析，最后將獲得的數(shù)據(jù)進行處理。
先進片段分析（Advanced fragment analysis，AFA），是片段分析中較為領先的技術。原理是設計針對不同目標靶點的引物，每個靶點擴增得到的產物至少有1bp以上的差別。交第三方合成引物并在末端標記熒光，不同大小片段采用不同顏色熒光標記，進行多重聚合酶鏈反應（PCR），使得所有靶點的核酸片段都帶熒光標記（圖A）。產物預處理后，進行毛細管電泳，利用熒光檢測器對不同片段大小的產物進行識別和區(qū)分（圖B）。使用軟件分析數(shù)據(jù)來決定以下結果：
1）大?。悍治鲕浖妹糠N樣品中的標準尺寸為每種樣品創(chuàng)建一條標準曲線，
然后通過熒光標記片段與標準曲線的比較獲得片段的相對大小。
2）基因型：分析軟件根據(jù)用戶自定義的基因位點來分配等位基因。
FA操作過程
FA發(fā)展歷史
a) 瓊脂糖凝膠電泳
瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。它兼有“分子篩”和“電泳”的雙重作用。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。由于糖-磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數(shù)量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此它們能以同樣的速率向正極方向移動。遷移速度與核酸分子本身的大小和構型有關，相同電場強度下，分子量較小的DNA分子遷移較快。
瓊脂糖凝膠分離DNA片段大小范圍較廣，不同濃度瓊脂糖凝膠可分離長度從200bp至近50kb的DNA片段。其分辨率雖比PAGE電泳低，但它制備容易。瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。裝置如圖所示：
1.PAGE電泳
聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide gelelectrophoresis，簡稱PAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。聚丙烯酰胺凝膠為三維網(wǎng)狀結構，具有分子篩效應。
聚丙烯酰胺分離小片段DNA（5-500bp）效果較好，其分辨力極高，甚至相差1bp的DNA片段就能分開。聚丙烯酰胺凝膠電泳很快，可容納相對大量的DNA，但制備和操作比瓊脂糖凝膠困難。聚丙烯酰胺凝膠采用垂直裝置進行電泳。
1.HPLC|DHPLC
高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography \ HPLC）以液體為流動相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離后，進入檢測器進行檢測，從而實現(xiàn)對試樣的分析。
變性高效液相色譜分析（denaturing high performance liquid chromatography \ DHPLC），在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發(fā)現(xiàn)DNA突變。異源雙鏈DNA與同源雙鏈DNA的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區(qū)的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現(xiàn)為雙峰或多峰的洗脫曲線。
DHPLC是一種基因突變篩查技術，能夠自動化、高通量進行，且除PCR之外，勿需進行PCR引物修飾、購買特殊試劑、檢測標記信號或作其它的樣品處理。DHPLC靈敏度和特異性較高、檢測DNA片段和長度變動范圍廣、相對價廉。檢測每個樣品只需要8分鐘左右，且能夠純化DNA片斷。只能檢測雜合突變是DHPLC的不足之處，但是可以通過純合突變樣品和野生型樣品混合的方法來解決。
1.毛細管電泳
毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）又稱高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE），是一類以毛細管為分離通道、以高壓直流電場為驅動力的新型液相分離技術。毛細管電泳實際上包含電泳、色譜及其交叉內容，它使分析化學得以從微升水平進入納升水平。
毛細管電泳通常使用內徑為25-100μm的彈性（聚酰亞胺）涂層熔融石英管。具有：高效、快速、微量、儀器簡單、易自動化、操作方便、應用范圍廣等優(yōu)點。
FA技術特點
傳統(tǒng)的基因片段分析建立在凝膠電泳基礎上，利用片段大小以及電荷不同對核酸產物進行分離和分析，盡管應用普遍、成本較低，但是卻存在以下缺點：操作繁瑣；分辨率低，無法精確度量基因片段的堿基數(shù)；有EB污染，嚴重危害人類健康。
先進FA檢測技術的核心內容是多重PCR技術以及毛細電泳系統(tǒng)分離。在同一個PCR反應體系中包含多對引物，各引物特異性地結合相應的目的基因，進行多重PCR；通過毛細管電泳系統(tǒng)可對不同片段長度的PCR產物進行分離和識別，同時，根據(jù)峰面積的大小還可對不同產物進行定量分析。先進FA包含以下幾種先進的技術：
1.高特異性等位基因多重分析（Multiplexing Allele Specific Assay, MASA）：能在一個反應中同時分析多達15個SNP位點，可用于藥物基因組學分析；
2.高靈敏度高特異性病原體分析（High Sensitivity Pathogen Specific, HSPS）：在一個反應體系里面同事檢測與識別多個低拷貝數(shù)的病原體，用于感染性病原體的多重檢測。
傳統(tǒng)PCR僅應用一對引物，通過PCR擴增產生一個核酸片段，主要用于單一致病因子等的鑒定。
多重PCR特點：①高效性，在同一PCR反應管內同時檢出多種病原微生物，或對有多個型別的目的基因進行分型，特別是用一滴血就可檢測多種病原體.②系統(tǒng)性，多重PCR很適宜于成組病原體的檢測，如肝炎病毒，腸道致病性細菌，性病，無芽胞厭氧菌，戰(zhàn)傷感染細菌及細菌戰(zhàn)劑的同時偵檢.③經濟簡便性，多種病原體在同一反應管內同時檢出，將大大的節(jié)省時間，節(jié)省試劑，節(jié)約經費開支，為臨床提供更多更準確的診斷信息。
毛細管電泳特點：容積?。ㄒ桓?00 cm×75 μm 管子的容積僅4.4 μL）；側面/截面積比大，因而散熱快、可承受高電場（100-1000 V/cm）；可使用自由溶液、凝膠等為支持介質；在溶液介質下能產生平面形狀的電滲流。
由此，可使毛細管電泳具備如下優(yōu)點：
（1）高效：塔板數(shù)目在10-10 片/m 間，當采用CGE 時，毛細管電泳色譜圖，塔板數(shù)目可達10 片/m 以上；遠高于高效液相色譜；
（2）快速：一般在十分鐘內完成分離，快的僅需三分鐘；
（3）微量：進樣所需的樣品體積為nL 級；
（4）儀器簡單、易自動化；
（5）操作方便；
（6）應用范圍廣。
與直接測序相比：某一個基因位點是比較容易得知的，但要獲得一段完整的基因序列就很困難，若是得不到就無法進行直接序列比較。而如果標記離基因位點很近，那么可以通過標記分析推斷出突變基因的存在。標記分析要比直接基因測序快很多。
FA相關應用介紹
a) 臨床方面
i. 病原微生物
片段分析能夠準確、快速地檢測出致病的病原微生物。
按照疾病傳播途徑的不同，大致可以分為：蟲媒、呼吸道、寄生蟲、接觸、胃腸道、血液等。片段分析在這幾類疾病的病原微生物診斷應用中的成效顯著。例如，Jian Li, Yanhui Zhang等人研究了瘧原蟲的簡單重復序列（SSRs），區(qū)分了近600種用多態(tài)微衛(wèi)星標記的約氏瘧原蟲基因組。
除了對傳播瘧疾的瘧原蟲的研究，片段分析還被廣泛地用于呼吸道疾病的研究，如麻疹病毒、致肺結核的分支桿菌、水痘病毒、H1N1流感以及雞瘟病毒等。Maria A. Nagel, Don Gilden等人運用逆轉錄PCR技術和基因圖譜分析系統(tǒng)（GeXPS）以及毛細管電泳和熒光分析技術，克服了宏陣列和微陣列分析不能檢測潛伏在人神經中樞的水痘帶狀皰疹病毒（VZV）基因的缺點，該技術能夠快速分析VZV在人神經系統(tǒng)潛伏期時的所有基因轉錄。除了上述幾位研究人員，Meng Qin, Da-yan Wang等人也運用了GeXP基因分析系統(tǒng)研究了H1N1流感病毒，研究發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的靈敏度和特異性，并且該法可以用來檢測潛伏的混合感染，為流行性感冒的監(jiān)管提供了強有力的方法，同時也提供了一個研究相似病原體變異的平臺。而Jin Li, Nai-Ying Mao等人運用多重逆轉錄PCR技術和GeXP系統(tǒng)，對16種人呼吸道病毒進行了同時檢測，結果顯示這是一種快速的、高成本效益的、靈敏的、具有特異性且高通量的檢測呼吸道病毒感染的方法。
片段分析在寄生蟲方面也有研究應用。如利什曼蟲， Rolando Oddone,Carola Schweynoch等人運用多位點微衛(wèi)星分型分析技術（MLMT）根據(jù)15個獨立位點來識別利什曼蟲，結果證明MLMT適用于利什曼蟲亞屬的流行病學和菌株群體遺傳學的研究。
通過接觸傳播的如腺病毒、人乳頭瘤病毒（HPV）等。低危性HPV引發(fā)扁平疣、尋常疣等疣，高危性HPV引發(fā)陰莖癌、宮頸癌、直腸癌等癌癥。Meng-Jie Yang, Le Luo等人采用多重PCR和GeXP分析儀對11種人乳頭瘤病毒（其中包括9中高危型和2種低危型）進行檢測，結果表明GeXP-PCR是一種快速、高靈敏度、高通量的檢測多種HPV感染的方法。國內也有人運用GeXP-PCR對HPV進行檢測，如蘆春斌，楊夢婕等人利用該技術對5種不同亞型的HPV病毒進行檢測鑒別。
胃腸道傳播疾病方面研究如與手足口病的腸道病毒相關的檢測。目前已有的檢測方法有實時逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR）、內嵌套式PCR、限制性片段長度多態(tài)性-聚合酶鏈式反應（PCR-RFLP），這些方法都能夠鑒別不同血清的腸道病毒，然而實時RT-PCR和內嵌套式PCR只能檢測有限數(shù)量的血清，PCR-RFLP盡管能夠同時檢測多個血清樣本，可是價格卻比較貴，也很耗時耗人力，因此Xiumei Hu, Yong Zhang等人研究認為GeXP分析法是一種快速、低成本、高通量區(qū)分9種手足口病腸道病毒血清型的方法。
通過血液傳播的疾病如艾滋病、乙肝、丙肝等。它們均是由病毒引起的疾病，通過片段分析來檢測艾滋病病毒（人體免疫缺陷病毒HIV）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）等病毒的研究也有不少。肖信研究建立了用于廣西HIV-1流行毒株的實時熒光定量PCR方法，并對方法科學性進行評價，結果表明熒光定量PCR方法具有線性范圍廣，特異度高，重復性好，檢測下限低，檢測試劑穩(wěn)定性好，并與國際標準的NASBA法檢測結果高度相關，與國內標準的試劑盒產品具有較好的一致性，能適應廣西地區(qū)不同HIV-1亞型；該方法實用、可行，在病毒載量檢測、早期感染檢測、治療病人的耐藥監(jiān)測等方面具有良好的應用前景。尹菊囡采用多重巢式PCR技術研究構建一種快速、經濟、實用、可靠的同步檢測HBV、HCV和HIV-1的方法，結果表明該方法可同時檢測HBV、HCV和HIV-1,但其靈敏度和特異度需進一步鑒定。李桂明采用磁珠提取核酸技術建立了一種能同時檢測、鑒定和定量三種病毒的多重實時定量RT PCR檢測方法，將這種方法的靈敏度與Qiagen公司的病毒DNA和RNA提取試劑盒進行比較，結果表明它們有很好的相關性；且一種病毒核酸的擴增不會對其它兩種產生影響；該檢測體系具有很高的靈敏度，最低可達50拷貝/ml；與單重的檢測相比也顯示出很好的相關性；表明這種檢測體系有大規(guī)模用于獻血篩查的潛力。
ii. 個體化用藥
個體化藥物用藥是根據(jù)病人的年齡、身高體重、遺傳特征等因素，選擇適合病人的藥物種類和劑量，來顯著提高藥物療效并減少藥物毒性的一種用藥方案。
統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，絕大多數(shù)藥物在約1/3的使用者中不能取得滿意療效，約1/6的使用者發(fā)生不同程度的不良反應，總的安全有效率僅約50%。目前藥物不良反應是人類第五大死亡原因。為在基因組學的基礎上，通過將基因表達或單核苷酸的多態(tài)性與藥物的療效或毒性聯(lián)系起來，研究藥物如何由于遺傳變異而產生不同的作用，被稱為藥物基因組學。迄今已有100余種藥物經美國FDA批準貼上了遺傳標簽，用于提示不同基因型的患者在應用該藥物時可能產生的療效和毒性。因此，通過基因檢測可針對性地為每位患者“量身定做”一套最適合的治療方案，從而最大程度地提高治療的有效率，減少藥物的毒副作用，避免用藥不當貽誤時機。
片段分析技術被廣泛應用于腫瘤領域，包括乳腺癌、卵巢癌、結直腸癌、肺癌等。有卵巢癌病史的家族中常伴隨著BRCA1以及BRCA2基因突變，Herman等人通過多重連接探針擴增技術（MLPA ）分析BRCA1基因，對產物大小進行分析，意外的發(fā)現(xiàn)了在該基因的外顯子11有一段374bp的序列缺失，然而用傳統(tǒng)的測序法并未發(fā)現(xiàn)該現(xiàn)象。Pham等人通過小發(fā)夾狀RNA干擾乳腺癌干細胞的CD44，利用多重PCR結合片段分析法，經GeXP遺傳分析儀對干細胞相關基因的基因表達水平進行了研究，發(fā)現(xiàn)通過干擾CD44，會使得乳腺癌干細胞向非乳腺癌干細胞分化，基因表達水平也更相似，這為乳腺癌的治療提供了一種新的潛在的治療方法。Sadava等人研究靈芝對小細胞肺癌的療效，利用GeXP基因表達分析系統(tǒng)對與細胞循環(huán)及細胞凋亡相關的36個基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)其中經靈芝處理后的9個基因的表達水平與經化療藥物依托泊苷以及阿霉素治療后的不同。Dahan等人通過限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP）技術以及CEQ的分型研究了與用于治療結腸直腸癌的西妥昔單抗藥效相關的潛在基因EGFR、EGF、CCND1、FCGR2A和FCGR3A的多態(tài)性，研究發(fā)現(xiàn)FCGR3A F158V以及CCND1 A870G的多態(tài)性對預測藥效、總生存數(shù)具有獨立重大的意義。Drew等人利用GeXP多重基因表達分析系統(tǒng)、微陣列芯片法及實時熒光定量法對結腸普通組織、息肉及腫瘤組織的炎癥相關基因的表達水平進行了研究，結果表明GeXP表達譜分析法可實現(xiàn)同時對多個基因表達進行定量，相比實時熒光定量PCR方法，它更快速、價格更低，同時多個內參基因能確?；虮磉_水平的準確性。
在心血管疾病方面，也有用到片段分析方法進行相關研究。腎胺酶抗體具有血流動力學效應，它很可能參與調節(jié)心血管功能，Buraczynska等人通過PCR-RFLP方法對腎胺酶抗體基因上的3個SNP位點進行基因分型發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性與糖尿病第二類患者的高血壓相關，并發(fā)現(xiàn)rs10887800的等位基因G很可能會增加糖尿病患者中風的風險。LDLR基因的突變是家族性高膽固醇血癥最常見的病因，而大片段基因重組在LDLR基因突變中所占比例高達10%，Goldmann等人利用MLPA方法首次發(fā)現(xiàn)非同源末端連接（non-homologous end joining, NHEJ）參與LDLR的基因重組。Botto等人利用測序并結合PCR-RFLP方法，研究LMNA基因的突變，該基因突變與擴張型心肌病密切相關，研究發(fā)現(xiàn)了在最常見的R190W突變旁邊有一類新的錯義突變R189W。張陽東等人還通過GeXP平臺對冠心病相關基因表達分析中的管家基因的表達水平進行了比較，并提出β-actin和SRP14可作為檢測CAD相關基因表達水平的內參基因。寧波海爾施基因科技有限公司也非常關注心血管疾病相關研究，在AFA技術上開發(fā)了多項專利，如“一種指導華法林用藥的多重基因檢測試劑盒及其檢測方法”已被授權，通過對藥物靶標及參與藥物代謝等基因的遺傳多態(tài)性的診斷，用于華法林抗凝的安全性指導；同時，還開發(fā)了針對β-受體阻斷藥用藥、噻嗪類利尿藥降壓藥以及血管擴張藥硝酸甘油的多重基因檢測試劑盒，目前正在審核過程中。
片段分析方法還被用于其它疾病的研究，如淋巴細胞性白血病、肌萎縮、抑郁癥等。
iii. HLA分型
在組織或器官移植中供者與受者之間相容(不排斥)還是不相容(排斥)都是由它們組織特異性所決定的。這種代表個體特異性的組織抗原稱組織相容性抗原，一套這樣的抗原系統(tǒng)稱主要組織相容性系統(tǒng)(major histocompatibility system,MHS)。編碼MHS的基因群稱為主要組織相容性復合體MHC。人的MHC就稱HLA(human leukocyte antigen)，是迄今已知基因中等位基因多態(tài)性最高的基因復合體。 HLA包括有I類II類和III類基因部分。實踐證明，HLA相同的同胞供者的腎移植，90%以上效果良好；單體型不同的供者，效果明顯下降；兩單型皆不同者則很少存活。
以往，用于HLA分型的方法主要是血清學和細胞學方法，由于其方法學上的缺點，分型的準確性較差，且不能進行亞型分析。最近幾年，隨著分子生物學的不斷進步，特別是PCR技術的廣泛應用，HLA基因分型技術得到了迅速的發(fā)展，各具特點的不同HLA基因分型技術不斷出現(xiàn)，在方法學上達到了穩(wěn)定、準確、精細、簡便、實用的程度，為其臨床推廣應用奠定了技術基礎。鄔于川等人應用PCR-RFLP（限制性片段長度多態(tài)性）方法進行了HLA-DP B1 等位基因與四川漢族人哮喘的相關性研究。黃飛等人進行PCR-SSP(序列特異性引物)/PCR-SBT-HLA(直接測序分型) 高分辨等位基因分型比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法具有實驗互補意義。若同時應用兩種方法能夠有效改善HLA 等位基因高分辨分型的準確性和重復一致率。
值得注意的是，目前臨床用血多為成分輸血，成分血分離自全血，不可避免會殘留少量白細胞或血小板。而有核細胞或血小板表面存在的HLA會隨著輸血進入患者體內，異體HLA抗原可對患者的HLA分型判定產生干擾?，F(xiàn)報道1例接受過多次大量成分血輸注治療的重型再生障礙性貧血患者，由于未嚴格按HLA分型血標本規(guī)定時間間隔進行血標本采集，導致HLA低分辨基因分型結果無法判定。
1.親權鑒定
古代滴血認親的方法，造成了不少冤案。如今，有了片段分析法，就可以快速、準確的鑒定親權關系。
楊玉發(fā)等人，采用PCR復合擴增技術、毛細管電泳及五色熒光自動化檢測技術對143例親權鑒定案例389份血液樣本，進行了15個STR基因位點和1個Amelogenin性別基因位點檢測分析，得出結論：STR基因檢測位點多，多態(tài)性高,DNA片段短、造成錯配和優(yōu)先擴增的可能性小，提高了PCR擴增的成功率和靈敏度，而且標本用量少(一般僅為0.1ng模板DNA),因此,STR基因位點檢測技術可以作為親權鑒定的主要技術手段。潘猛等人，取2011~2012年來自江蘇省的262份無血緣關系的漢族個體，對24個STR位點進行復合擴增,ABI3130自動基因分析儀進行片段分析并進行基因分型，分析了24個Y染色體短串聯(lián)重復序列(STR)基因座在江蘇漢族群體的基因多態(tài)性、基因頻率和其他地域人群之間的遺傳距離。
1.其他方面
產前診斷、個體識別等
