基本介紹

先將生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。

操作步驟

1. 配制瓊脂糖EB凝膠，電泳以分離DNA片段。任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都可以使用。

我們強(qiáng)烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復(fù)使用電泳緩沖液，舊的電泳緩沖液PH會(huì)增加而降低DNA的回收產(chǎn)量；

2. 電泳足夠時(shí)間后，在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。

注意：DNA在紫外燈下的曝光的時(shí)間不要超過30秒，同時(shí)在紫外燈下操作的時(shí)候一定要戴保護(hù)眼鏡。

3. 稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為1g/ml，于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算：凝膠薄片的重量為0.2g 則其體積為0.2ml；加入等倍凝膠體積的Binding Buffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠完全融化，其間每隔2-3分鐘混勻一次；

重要提醒：在凝膠完全溶解之后，注意凝膠-Binding Buffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少。觀察混合物的顏色，如果是橙色或紅色，則要加入5μl 濃度為5 M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值。經(jīng)過這一調(diào)節(jié)，該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。一般情況下，使用新鮮的電泳緩沖液，凝膠－Binding buffer混合物的PH值的不會(huì)升高；

4. 轉(zhuǎn)移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBindTM DNA柱子，并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi)，室溫下，10,000×g離心1min，棄去液體。

一個(gè)HiBind DNA柱子最多可容納700μl的溶液，如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl，可先轉(zhuǎn)移700μl溶液至柱子，離心完后，將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上。但是每一個(gè)HiBindTM柱子最多可以結(jié)合25~30μg DNA。如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱中。

5. 將柱子重新套回收集管中，加300μl Binding Buffer至HiBind DNA 柱子中；室溫下，10,000×g離心 1分鐘，去棄濾出液；這一步相當(dāng)關(guān)鍵，不要忽略此步。

6. 將柱子重新套回收集管中，加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；注：SPW Wash buffer在使用前必須按瓶子標(biāo)鑒要求用無水乙醇進(jìn)行稀釋。

7. 將柱子重新套回收集管中，重復(fù)加入700μl SPW Wash buffer至HiBind DNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液；

8. 棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10,000×g離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。

這步可以去除柱子基質(zhì)上殘余的乙醇，不要省略此步―――對(duì)得到好的DNA產(chǎn)量是十分重要的。

9. 把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1分鐘，離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物，保存于-20度。

如果再洗脫一次的話可以把殘余的DNA洗脫出來，不過那樣的濃度就會(huì)較低。

DNA的產(chǎn)量及質(zhì)量：

把純化產(chǎn)物的樣品稀釋一定的倍數(shù)后，分別在260nm和280nm下測(cè)其光吸收值，回收得到的DNA的濃度可按以下公式來計(jì)算： DNA濃度=光吸收260×50×稀釋倍數(shù)μg/ml

長度大于500bp的片段通常能純化得到80%的產(chǎn)量。而50bp~500bp的帶則可達(dá)到55%~80%的回收率。(光吸收260/光吸收280)的比率是核酸純度的一個(gè)標(biāo)記。如果此值1.8，則意味著核酸的純度>90%。另一方面，如果純化產(chǎn)物的產(chǎn)量較低時(shí)，可以用瓊脂糖EB電泳估算產(chǎn)物的濃度。