TRIzol（新型總RNA抽提試劑）

主要成分

TRIzol

TRIZOL是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA。

※0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。

※異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。

※β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。

基本特點(diǎn)

Trizol試劑

Trizol試劑能促進(jìn)不同種屬不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7 kb和15 kb之間不連續(xù)的高分子量條帶，（mRNA和hnRNA成分）兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介于0.1 和 0.3 kb之間 (tRNA,5S）。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)其A260/A280比值≥1.8

使用方法

該法從細(xì)胞中提取RNA——用勻漿器將組織磨碎，加入TRIzol處理組織。5分鐘后加入氯仿，以每分鐘12000轉(zhuǎn)離心5分鐘，樣品即分成水樣層、中間層和有機(jī)層。

※RNA存在于水樣層中，收集水樣層后可以通過異丙醇沉淀RNA來還原。

※在除去水樣層后，中間層中的DNA和蛋白質(zhì)也能相繼以沉淀的方式還原：乙醇能使中間層的DNA沉淀析出，在中間層中加入異丙醇能沉淀出蛋白質(zhì)。

每100ml TRIzol可以抽提100個(gè)六孔板中的樣品或100個(gè)50-80mg的組織樣品。無論樣品是人、動物、植物還是細(xì)菌組織，該方法對少量的組織（50-100mg)和細(xì)胞（約五百萬個(gè)）及大量的組織（≥1g）和細(xì)胞（超過一千萬個(gè)）均有較好的分離效果。

每一百萬細(xì)胞用TRIzol抽提可得5-15微克RNA，每毫克組織用TRIzol抽提可得1-10微克RNA（產(chǎn)量因細(xì)胞和組織不同而異）。

TRIzol操作上的簡便性允許其同時(shí)處理多個(gè)樣品，所有的操作可以在一小時(shí)內(nèi)完成。

TRIzol抽提的總RNA能夠避免DNA和蛋白質(zhì)的污染，故而能夠作RNA 印跡分析、斑點(diǎn)雜交、poly(A)+ 選擇、體外翻譯、RNA酶保護(hù)分析和單分子克?。≒CR）。

※如果是用于PCR，當(dāng)兩條引物位于單一外顯子內(nèi)時(shí)，建議用級聯(lián)擴(kuò)大的DNase I(Cat. No. 18068）來處理抽提的總RNA。

※TRIzol試劑能促進(jìn)不同種屬、不同分子量大小的多種RNA的析出。例如，從大鼠肝臟抽提的RNA經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳并用溴化乙啶染色，可見許多介于7kb和15kb之間的不連續(xù)的高分子量條帶（mRNA和hnRNA成分），兩條優(yōu)勢核糖體RNA條帶位于~5 kb （28S）和~2 kb （18S），低分子量RNA介于0.1和0.3kb之間 (tRNA,5S）。當(dāng)抽提的RNA用TE稀釋時(shí)，其A260/A280比值≥1.8。抽提小RNA時(shí)宜-70℃沉淀過夜。

TRIzol對人體有害，使用時(shí)應(yīng)戴一次性手套，注意防止濺出。

⒈樣品的制備 當(dāng)樣品富含蛋白質(zhì)，脂肪，多糖或是細(xì)胞外物質(zhì)例如肌肉，脂肪組織和植物的塊莖部分時(shí)可能需要一額外的分離步驟。勻漿化后在2—8°C的條件下以12,000×g的離心力離心10分鐘，移除勻漿中不溶解的物質(zhì)，余下的沉淀中包含有細(xì)胞外膜，多糖，以及高分子量DNA，而上層的超浮游物含有RNA。在來自于脂肪組織的樣品中，大量的脂肪漂在最上層因而應(yīng)該除掉。在每一個(gè)個(gè)案中，將清亮的勻漿溶液轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中加入氯仿并繼續(xù)進(jìn)行下述的分離步驟。

⒉ 分離階段 將勻漿樣品在15—30°C條件下孵育5分鐘以使核蛋白體完全分解。每1 ml TRIZOL加0.2 ml氯仿。蓋緊樣品管蓋，用手用力搖晃試管15秒并將其在30°C下孵育2—3分鐘。在2—8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心15分鐘。離心后混合物分成三層：下層紅色的苯酚-氯仿層，中間層，上層無色的水樣層。RNA無一例外地存在于水樣層當(dāng)中。水樣層的容量大約為所加TRIZOL容量的60%。

⒊ RNA的沉淀 將水樣層轉(zhuǎn)移到一干凈的試管中，如果希望分離DNA和蛋白，有機(jī)層同樣要予以保留。通過將水樣層和異丙醇混合來沉淀RNA。最初均化時(shí)的每1 ml TRIZOL對應(yīng)0.5 ml異丙醇。將混合的樣品在15—30°C條件下孵育10分鐘并在2—8°C下以不超過12,000×g的離心力高速冷凍離心10分鐘。RNA沉淀在離心前通常不可見，形成一膠狀片狀沉淀附著于試管壁和管底。

4 .RNA的洗脫 移去上層懸液。用75%的乙醇洗滌RNA沉淀一次，每1 ml的 TRIZOL至少加1 ml的75%乙醇。旋渦振蕩混合樣品并在2—8°C下以不超過7,500×g的離心力高速冷凍離心5分鐘。

⒌ RNA的再溶解 在操作的最后，簡單干燥RNA沉淀（空氣干燥或真空干燥5—10分鐘）不要在真空管里離心干燥RNA。尤為重要的是，不能讓RNA沉淀完全干燥那樣會極大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA樣品其A260/280比值< 1.6。用移液管尖分幾次移取無RNA酶的水或0.5% SDS溶液來溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分鐘（當(dāng)RNA以后要用于酶切反應(yīng)時(shí)，避免使用SDS。）RNA還能被100%甲酰胺（除去離子）再溶解并保存在–70°C。

RNA抽提注意事項(xiàng)

⒈從少量的組織（1—10 mg）或細(xì)胞（102—104）中分離RNA 樣品：往組織或細(xì)胞中加入800 μl TRIZOL。待樣品裂解后，加入氯仿并進(jìn)行步驟2中的抽提操作。在用異丙醇沉淀RNA之前，加入5—10μg無RNA酶的脂質(zhì)體(CatNo 10814）作為水樣層的載體。為降低其黏度在加入氯仿前用26號注射器抽吸兩次以切斷基因組DNA。脂質(zhì)體會留在水樣層中并和RNA共析出。在濃縮到4 mg/ml之前它不會抑制第一絲狀體的合成也不會抑制PCR。

⒉在勻化后和加入氯仿之前，樣品可以在–60—–70°C保存至少一個(gè)月。RNA沉淀（步驟4，RNA洗脫）溶于75%的乙醇在2—8°C至少可以保存一周，在–5—–20°C下至少可保存一年。

⒊臺式離心機(jī)最大能達(dá)到2,600×g的離心力，如果將離心時(shí)間延長到30-60分鐘可以滿足步驟2和步驟3中的操作。

配制方法

在2000ml的燒杯中加入以下物質(zhì)，混合均勻：

500ml重蒸苯酚；

250g異硫氰酸胍；

293mL蒸餾水；

⒘6mL 0.75M 檸檬酸鈉溶液（pH≥7）

26.4mL 10%sarcosy（十二烷基肌氨酸鈉）溶液

50mL 2M NaAc溶液（pH≥4）

TRIzol需4℃低溫保存，保質(zhì)期約一年。100mL TRIzol試劑市場售價(jià)約478元人民幣。

注釋：⑴水和苯酚部分互溶，Trizol中苯酚被水飽和，形成均勻溶液；⑵NaAc等鹽類的作用是提供緩沖環(huán)境。

選擇

互溶，Trizol中苯酚被水飽和，形成均勻溶液；⑵