無血清培養(yǎng)基（用于制備單克隆抗體等的培養(yǎng)基）

基本介紹

無血清培養(yǎng)基是不需要添加血清就可以維持細胞在體外較長時間生長繁殖的合成培養(yǎng)基。

無血清培養(yǎng)基的基本配方：基本成分為基礎培養(yǎng)基及添加組分兩大部分。用于生物制藥和疫苗生產的細胞在體外培養(yǎng)時，多數呈貼壁生長或兼性貼壁生長；而當其在無血清、無蛋白培養(yǎng)基中生長時，由于缺乏血清中的各種粘附貼壁因子如纖粘連蛋白、層粘連蛋白、膠原、玻表粘連蛋白，細胞往往以懸浮形式生長。

組分簡介

1.促貼壁物質：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養(yǎng)基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖連蛋白、層粘連蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞等。

2.促生長因子及激素：針對不同細胞添加不同的生長因子。激素也是刺激細胞生長、維持細胞功能的重要物質，有些激素是許多細胞必不可少的，如胰島素。

3.酶抑制劑：培養(yǎng)貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養(yǎng)基中必不可少須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。最常用的是大豆胰酶；抑制劑。

4.結合蛋白和轉運蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。牛血清白蛋白的添加比較大，可增加培養(yǎng)基的粘度，保護細胞免受機械損傷。許多旋轉式培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基都含有牛血清白蛋白。

5.微量元素：硒是最常見的。

使用方法

目前，血清仍是動物細胞培養(yǎng)中最基本的的添加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，待細胞生長旺盛以后，再換成無血清培養(yǎng)液。細胞轉入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)要有一個適應過程，一般要逐步降低血清濃度，從10%減少到5%，3%，1%，直至無血清培養(yǎng)。在降低過程中要注意觀察細胞形態(tài)是否發(fā)生變化，是否有部分細胞死亡，存活細胞是否還保持原有的功能和生物學特性等。在實驗后這些細胞一般不再繼續(xù)保留，很少有細胞能夠長期培養(yǎng)于無血清培養(yǎng)基而不發(fā)生改變的。細胞轉入無血清培養(yǎng)之前，要留有種子細胞，種子細胞按常規(guī)培養(yǎng)于含血清的培養(yǎng)基中，以保證細胞的特性不發(fā)生變化。

為了使細胞適應無血清培養(yǎng)，關鍵的是使所培養(yǎng)細胞：

1.處于對數生長中期

2.>90% 活細胞率

3.適應時以較高的起始細胞接種

細胞適應無血清培養(yǎng)基的方法

1.直接適應——細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中。

一些類型細胞可直接從包含血清的培養(yǎng)基適應無血清培養(yǎng)基。對于直接適應，接種細胞密度應該:2.5×10~3.5×10細胞/ml。當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml時，傳代培養(yǎng)細胞。當細胞密度在培養(yǎng)4到7天后達到2×10~4×10細胞/ml時，細胞完全適應了無血清培養(yǎng)基。每隔3~5天，當細胞密度達到1×10~3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。

2.連續(xù)適應——分好幾步把細胞從添加血清的培養(yǎng)基轉換到無血清培養(yǎng)基（SFM）中，與直接適應相比較，連續(xù)適應趨向對于細胞更加溫和一些。

（1）以2倍正常接種密度接種生長活躍的細胞培養(yǎng)物到75%有血清培養(yǎng)基：25%SFM 混合培養(yǎng)基中，傳代培養(yǎng)。

（2）當細胞密度>5×10細胞/ml時，以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，在有血清培養(yǎng)基：SFM為50∶50的混合培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（3）以2×10到3×10細胞/ml細胞密度，25%有血清培養(yǎng)基和75% SFM中傳代培養(yǎng)。

（4）當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml（接種后4到6天），在100%SFM培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)。

（5）每隔3到5天，當細胞密度達到1×10到3×10細胞/ml，細胞活率在90%時，貯備的適應了無血清培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)物應該再次傳代培養(yǎng)。

建議備份前一次混合培養(yǎng)的培養(yǎng)物，直到每一次細胞適應了新的混合培養(yǎng)基。每一次減少血清前，可能需要在SFM/有血清混合培養(yǎng)基中進行幾次傳代。

在適應過程中，最好不要讓細胞生長過度。這將增加選擇亞群的可能性。需要注意，與有血清培養(yǎng)基相比，大部分SFM包含非常少的蛋白質，因而更易于受外界因素的影響。

細胞培養(yǎng)適應替代血清：許多細胞利用連續(xù)適應方法能很好的適應，用包含FBS的的培養(yǎng)基和包含有替代血清的培養(yǎng)基1∶1（v∶v）的混合培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。通過下列的混合培養(yǎng)基的方式，連續(xù)幾代減少當前培養(yǎng)基的量：1∶2，1∶4，1∶16和100%替代培養(yǎng)基。每次適應改變血清比例時，傳代細胞2到3次。

培養(yǎng)可以直接從FBS轉換到替代血清。一開始就使用相同于FBS的濃度的替代物或血清，生長的延遲可能會發(fā)生，4允許進行2到3次的傳代，使生長率恢復到以前的水平。

特別需要強調的是：配制無血清培養(yǎng)液必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為無血清培養(yǎng)基缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養(yǎng)能否成功的關鍵因素之一。

主要優(yōu)缺點

1.可避免血清批次間的質量變動，提高細胞培養(yǎng)和實驗結果的重復性。

2.避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染。

3.避免血清組分對實驗研究的影響。

4.有利于體外培養(yǎng)細胞的分化。

5.可提高產品的表達水平并使細胞產品易于純化。

缺點：

1.細胞在無血清培養(yǎng)基中易受某些機械因素和化學因素的影響，培養(yǎng)基的保存和應用不如傳統(tǒng)的合成培養(yǎng)基方便。

2.成本較高。

3.針對性很強，一種無血清培養(yǎng)基僅適合某一類細胞的培養(yǎng)。

培養(yǎng)細胞配方

1.神經細胞，干細胞，PC12細胞

成份 終濃度

葡萄糖－－0.6%

谷氨酰胺－2mM

NaHCO3－－3mM

Hepes －－5mM

胰島素－－2.5μg/ml

轉鐵蛋白 －100ng/ml

孕 酮 －－20nM

丁二胺－－60μM

硒酸鈉－－30nM

青霉素－－50mg/ml

鏈霉素－－50mg/ml

最后用DF12添加到100ml即可

2.各類小鼠胚胎癌細胞系培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO2.4g

HEPES(1.5M) 10.0ul

硒酸（5*10-6M) 10.0ug

纖粘連蛋白 1ug/cm(37度作用15－30分鐘）

胰島素 1000.0ug

轉鐵蛋白 5000.0ug

3.NIH3T3小鼠成纖維細胞培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

HEPES 15mM

大豆胰酶抑制劑 0.1%

胰島素 10.0ug/ml

轉鐵蛋白 25.0ug/ml

纖粘連蛋白 5.0ug/ml

4.雜交瘤細胞培養(yǎng)基

DMEM/F12 1:1混合成1000ml

NaHCO1.2g/L

HEPES 15mM

胰島素 5.0ug/ml

氨基乙醇 20.0uM

硒酸 2.5mM

轉鐵蛋白 35.5ug/ml

應用：無血清培養(yǎng)基和試劑被廣泛的應用于培養(yǎng)哺乳動物和無脊動物細胞以制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。大多數的無血清產品含有向細胞內轉運離子的轉鐵蛋白和調節(jié)葡萄糖攝取量的胰島素，以及一些蛋白質如清蛋白，纖連蛋白，胎球蛋白等，這些蛋白在細胞培養(yǎng)中發(fā)揮各種不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反應器剪切力，提供細胞貼壁所需的基質，作為脂類和其他生長因子的載體等。

種類分類

LONZA公司 無血清培養(yǎng)基

12-725F UltraCULTURE MEDIUM(Serum-free general purpose medium) 500ml

產品簡介：一種通用的無血清培養(yǎng)劑

適用范圍：培養(yǎng)貼壁和懸浮哺乳動物細胞，疫苗生產中病毒顆粒的制備

產品：

77232 PC-1Complete Serum-free Medium 500ml

77230 PC-1 Complete Serum-free Medium(powder plus supplement) 10L

344022 PC-1 Supplement (50) 10ml

產品簡介：是一種低蛋白，無血清培養(yǎng)基。PC-1培養(yǎng)基旨在應用于各種研究和工業(yè)用途，使用限定成份配制的培養(yǎng)基確保在維持最低蛋白成分同時使細胞獲得最佳的生長狀態(tài)。

適用范圍：培養(yǎng)原代細胞和貼壁依賴性細胞

產品：

12-743F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Low-protein medium containing L-glutamine &ITES) 500ml

12-745F UltraMEM Reduced Serum Medium

(Protein-free basal medium without L-glutamine) 500ml

產品簡介：用于支持多種貼壁信賴性細胞在低血清濃度下的正常生長的限定培養(yǎng)基。

適用范圍：培養(yǎng)貼壁信賴性細胞

產品：

12-724Q UltraCHO Meidum(1*liquid with L-glutamine) 1L

12-715F UltraCHO Meidum(1*liquid without nucleosides) 500mL

17-811A UltraCHO Supplement(Non-sterile) 100ml

產品簡介：培養(yǎng)基最適于培養(yǎng)轉染和未轉染的中國倉鼠卵巢細胞（CHO）細胞，表達重組蛋白質。

適用范圍：培養(yǎng)CHO細胞; 重組蛋白的合成。

產品：12-749Q UltraMDCK Meida 1L

產品簡介：是一種無血清限定培養(yǎng)劑，適于高/低平板密度培養(yǎng)MADIN-DABBY犬腎細胞（MDCK）

適用范圍：培養(yǎng)供體外診斷（IVD）用的MDCK細胞

產品：

12-764Q PRO 293A-CDM 1L

12-765Q PRO 293S-CDM 1L

產品簡介：用于293細胞（轉化的人胚腎細胞）培養(yǎng)Pro293限定培養(yǎng)基系統(tǒng)是專為促進293細胞重組蛋白的合成和下游反應而開發(fā)的。這些配方不需要任何動物來源的成分即可支持高密度的培養(yǎng)

適用范圍：293細胞重組蛋白和合成

產品：12-730Q Insect-XPRESS Medium 1L

產品簡介：采用一種無蛋白配方，適合培養(yǎng)來源于Spodoptera frugiperda(Sf9和Sf21)的昆蟲細胞系。

適用范圍：桿狀病毒的增殖，重組蛋白的表達。

產品：77203 HL-1 Complete Serum-free Medium(powder) 10L

產品簡介：HL-1TM完全無血清培養(yǎng)基是一種限定培養(yǎng)基，蛋白含量低于30ug/ml. HL-1TM完全無血清培養(yǎng)基不含牛血清白蛋白和其它不明蛋白混合物。

適用范圍：雜交瘤細胞和淋巴細胞來源的分化細胞的無血清培養(yǎng)。

產品：12-723 BUltraDOMA Medium 500ml

產品簡介：適用于中空纖維反應器中進行中，鼠和嵌合雜交瘤細胞的培養(yǎng)及上述細胞的批量培養(yǎng)。

適用范圍：雜交瘤細胞的培養(yǎng)，單克隆抗體的制備。

產品：12-727F FUltraDOMA-P.F.Protein-free Medium 500ml

08-024B Ultra DOMA-P.F.Protein-free Medium 10L

產品簡介：一種不含蛋白的培養(yǎng)基，適于鼠，人和嵌合細胞來源的雜交瘤細胞系的培養(yǎng)。

適用范圍：雜交瘤細胞和骨髓瘤細胞的培養(yǎng)，單克隆抗體的制備。

XVIVO系利產品

產品：

04-380Q X-VIVO 10 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-743Q X-VIVO 10 w/o Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產品簡介：為了有助于在無血清環(huán)境中制備淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)而設計的。

產品：

04-418Q X-VIVO 15 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

04-744Q X-VIVO 15 w/o Gentamicin or Phenol Red, 1 L

產品簡介：在組成上和X-VIVO 10相似，并且經過調整優(yōu)化使之適合于無血清條件下腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）的增殖，其配方有助于外周學及人類腫瘤中分離純化的CD3+細胞的增殖。同時還用于維持人類單核細胞、巨噬細胞及細胞系、粒細胞和自然殺傷細胞（NK）的生長。

產品：04-448Q X-VIVO 20 with Gentamicin and Phenol Red, 1 L

產品簡介：經過改進和優(yōu)化有助于單核細胞耗竭的高密度的外周淋巴細胞制備LAK細胞。

價格：待定

存儲條件：2℃-8℃

三種培養(yǎng)的部分細胞類型應用如下：

人和鼠淋巴因子激活殺傷細胞（LAK）；外周血淋巴細胞（PBL）；人和鼠腫瘤浸潤淋巴細胞（TIL）；人T細胞；人和鼠巨噬細胞；人和鼠造血干細胞（克隆形成和增殖）；人體組織的冰凍保存。

X-VIVO 產品的其他應用包括：

PBL的增殖；TIL的增殖；器官的冰凍保存和移植；人單核細胞和巨噬細胞的培養(yǎng)；干細胞的培養(yǎng)；樹突狀細胞的培養(yǎng)。